CRISPR) to technika edycji genomu trzeciej generacji: CRISPR zrewolucjonizował świat

CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) to technika edycji genomu trzeciej generacji, która zrewolucjonizowała świat dzięki swoim wysokoprzepustowym wynikom. Została wykorzystana w leczeniu różnych chorób biologicznych i infekcji. Różne bakterie i inne prokarioty (takie jak archeony) również posiadają systemy CRISPR/Cas9 do obrony przed fagami. Doniesiono, że strategie oparte na CRISPR/Cas9 mogą hamować wzrost i progresję potrójnie ujemnego raka piersi (TNBC) poprzez ukierunkowanie potencjalnie zmienionych genów oporności, transkrypcji i regulacji epigenetycznej. Te interwencje terapeutyczne mogą pomóc w rozwiązaniu trudnych problemów, takich jak lekooporność obserwowana nawet w TNBC. Obecnie stosuje się różne metody dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek docelowych, takie jak fizyczne (mikroiniekcja, elektroporacja i tryby hydrodynamiczne), wirusowe (wirusy towarzyszące adenowirusom i lentiwirusy) i niewirusowe (liposomy i nanocząsteczki lipidowe). )-cząsteczki). Chociaż opracowano różne modele do badania molekularnych przyczyn TNBC, brak czułych i ukierunkowanych metod dostarczania narzędzi do edycji genomu in vivo ogranicza ich zastosowanie kliniczne. Podsumowując, niniejszy przegląd kompleksowo analizuje postęp, wyzwania, ograniczenia i perspektywy leczenia TNBC metodą CRISPR/Cas9 w oparciu o istniejące dowody. Podkreślamy również, jak połączenie sztucznej inteligencji i uczenia maszynowego może udoskonalić strategie CRISPR/Cas9 w leczeniu TNBC.
Rak charakteryzuje się niekontrolowanym podziałem komórek, zaburzeniami punktów kontrolnych cyklu komórkowego oraz mutacjami w genach supresorowych nowotworów (TSG) (Matthews i in., 2022). Spośród różnych rodzajów nowotworów, rak piersi jest najczęstszym nowotworem u kobiet i charakteryzuje się wysoką śmiertelnością na całym świecie (Waks i Winer, 2019). Rak piersi jest chorobą heterogenną o zróżnicowanych cechach, takich jak cechy histologiczne i biologiczne, obraz kliniczny i zachowanie oraz odpowiedź na leczenie (Weigelt i in., 2010). Klasyfikacja raka piersi dostarcza precyzyjnych informacji na temat diagnostyki i rokowania. Wykorzystanie wspólnych biomarkerów i cech kliniczno-patologicznych stanowi główne kryterium klasyfikacji raka piersi (Tsang i Tse, 2019). Rokowanie i odpowiedź na leczenie raka piersi zależą od wielu czynników, w tym obecności receptora estrogenowego (ER), receptora progesteronowego (PR), receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2/neu) oraz stopnia histologicznego, rodzaju guza i stopnia, rozmiaru oraz przerzutów do węzłów chłonnych (Al-Tubaiti, 2020). Zidentyfikowano pięć wewnętrznych podtypów molekularnych raka piersi, w tym luminalny A, luminalny B, HER2-wzbogacony, basal-like i claudin-low (Prat i in., 2015). TNBC to podtyp molekularny raka, który nie ekspresjonuje wszystkich ER, PR i HER2 (Yin i in., 2020). Te cechy patologiczne są związane z TNBC, potwierdzając jego szybki postęp i bardziej agresywny charakter niż jakikolwiek inny typ raka piersi (Feng i in., 2018). Ponadto Peru i in. (2000) wykorzystali technologię mikromacierzy do reklasyfikacji raka piersi i zidentyfikowania pięciu jego swoistych podtypów (Cadenas, 2012). Rak piersi typu basal-like to podtyp raka piersi o fenotypie potrójnie ujemnym i związanym z szybką progresją. Należy zauważyć, że wszystkie raki piersi typu basal-like są często błędnie diagnozowane jako TNBC, ale tylko 77% z nich to TNBC; natomiast 71–91% przypadków TNBC to TNBC typu basal-like, co wskazuje, że te dwa typy raka piersi nakładają się na siebie i reprezentują różne klasyfikacje (Wang D.-Y. i in., 2019). Stwarza to potrzebę scharakteryzowania heterogeniczności TNBC w celu wyjaśnienia rokowania i zidentyfikowania potencjalnych odpowiedzi na obecne i przyszłe metody leczenia. Ponadto TNBC stanowi 15–20% wszystkich przypadków raka piersi i jest częstszy u kobiet poniżej 50. roku życia. Mutacje BRCA1 lub BRCA2 odnotowano w około 20% przypadków TNBC (Xie i in., 2017; Tzikas i in., 2017). Badania wykazały również, że TNBC charakteryzuje się specyficznym mikrośrodowiskiem immunologicznym, które obejmuje wysoki poziom czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego, makrofagów towarzyszących guzowi (TAM), limfocytów naciekających guz (TIL) i innych cząsteczek zaangażowanych we wzrost i migrację guza. Dlatego zrozumienie mikrośrodowiska TNBC ma kluczowe znaczenie dla prognozowania i leczenia (Fan i He, 2022).
Aby ocenić rokowanie w TNBC i zapewnić skuteczne leczenie, istotna jest dokładna diagnoza, oparta głównie na immunohistochemii (IHC) w celu wykrycia receptorów ER, PR i HER2 oraz mammografii w celu wykrycia nowotworów piersi. Mammografia nie jest jednak w stanie odpowiednio zobrazować cech wewnątrzguzowych, takich jak martwica i włóknienie (Deepak Singh i in., 2021). Ponieważ złe rokowanie i diagnoza uniemożliwiają lekarzom przepisywanie odpowiednich leków (Chaudhary, 2020), w celu poprawy opieki nad pacjentami z TNBC stosuje się różne strategie. Obecnie u pacjentów z TNBC stosuje się dwa leki: doksorubicynę i cyklofosfamid, które przynoszą dobre rezultaty. Ponadto stosuje się inne leki platynowe, takie jak karboplatyna i cisplatyna (Sikov i in., 2015). Ponadto inhibitory PARP, takie jak Olaparib, Velaparib i PF-01367338, były stosowane jako potencjalne leki chemioterapeutyczne w leczeniu TNBC (Ishino i in., 2018). Ponieważ doniesiono, że szlaki sygnałowe Wnt/b-Katenina, NOTCH i Hedgehog biorą udział w występowaniu i postępie TNBC, ukierunkowanie leków na te szlaki może być ważną strategią (Aysola i in., 2013). Chociaż chirurgia, radioterapia i chemioterapia pozostają podstawą leczenia TNBC dzisiaj, poczyniono znaczny postęp w opracowywaniu nowych metod leczenia, w tym terapii celowanej, immunoterapii, różnych narzędzi edycji genów związanych z CRISPR, takich jak Cas9n, dCas9., CRISPR/Cas12, edycja podstawowa i terapia genowa ukierunkowana na CRISPR/Cas9. Tutaj skupimy się na różnych narzędziach edycji genów związanych z CRISPR stosowanych w leczeniu TNBC. Spośród nich CRISPR/Cas9 zyskało szerokie zainteresowanie.
Cas9n, znany również jako Cas9 nikaza, to genetycznie zmodyfikowany wariant białka Cas9, pochodzący z systemu edycji genomu CRISPR/Cas9 (Gupta i in., 2019). W swojej pierwotnej formie białko Cas9 zawiera dwie domeny nukleazowe: RuvC i HNH, których główną funkcją jest rozszczepianie obu nici DNA. Jednak w Cas9n jedna z domen nukleazowych, HNH, ulega mutacji genetycznej i staje się nieaktywna. W związku z tym domena HNH Cas9n pozostaje niefunkcjonalna. Aktywna pozostaje jedynie domena RuvC, co pozwala Cas9n na przecinanie lub tworzenie pęknięć na pojedynczych niciach DNA (Trevino i Zhang, 2014). W porównaniu z Cas9, Cas9n może skutecznie redukować efekty off-target i precyzyjnie usprawniać mechanizmy naprawy komórek. Cas9n może być używany do rozwiązywania różnych problemów, takich jak tworzenie pęknięć w określonych miejscach dwuniciowego DNA. W tym celu połączono i zastosowano dwie cząsteczki Cas9n (Yee, 2016). Kinaza linii mieszanej 3 (MLK3) to kinaza białkowa aktywowana mitogenami, która pełni funkcję kluczowego regulatora podczas przerzutów raka płaskonabłonkowego piersi (TNBC) (Cronan i in., 2012).
MLK3 może aktywować wiele szlaków sygnałowych prowadzących do przerzutów TNBC. Na przykład, szlak kinazy N-końcowej c-Jun (JNK) reguluje ruchliwość komórek i degradację macierzy zewnątrzkomórkowej, a MLK3 aktywuje szlak JNK, zwiększając w ten sposób ruchliwość komórek i nadając im właściwości inwazyjne (Rattanasinchai i Gallo, 2016). MLK3 reguluje również EMT. W tym celu aktywuje czynniki transkrypcyjne, takie jak Snail, Slug i Twist. Czynniki te hamują ekspresję markerów nabłonkowych i promują ekspresję markerów mezenchymalnych, prowadząc do nabycia fenotypu przerzutowego (Casalino i in., 2023). Zaobserwowano, że MLK3 odgrywa rolę w remodelingu ECM i aktywacji proteaz, takich jak metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP), które degradują ECM. Ułatwia to inwazję komórek nowotworowych i rozprzestrzenianie się na odległe obszary (Katari i in., 2019). Zatem wcześniejsze badania wykazały, że MLK3 odgrywa kluczową rolę w TNBC. Rattanasinchai i Gallo wykorzystali modele TNBC do zbadania roli MLK3 i odkryli, że promuje on rozwój raka poprzez specyficzne szlaki sygnałowe. Wykorzystali CRISPR/Cas9n do edycji MLK3 i zaobserwowali znaczną redukcję przerzutów TNBC (Rattanasinchai i Gallo, 2016).
dCas9, często nazywane nieaktywnym Cas9, jest zmodyfikowaną pochodną białka Cas9. W przeciwieństwie do aktywnego Cas9, dCas9 nie wykazuje aktywności endonukleazy, co uniemożliwia mu indukowanie pęknięć dwuniciowych DNA. Dlatego dCas9 może być używane do precyzyjnego celowania w określone regiony genomu bez żadnych zmian ani modyfikacji sekwencji DNA (Wang i in., 2016). W dCas9 dwa białka endonukleazy, RuvC i HNH, są inaktywowane poprzez supresję ważnych reszt aminokwasowych (Richter i in., 2016). Pomimo braku aktywności rozszczepiania DNA, dCas9 odgrywa szereg ważnych ról w badaniach genetycznych i biotechnologii. Na przykład, umożliwia wizualizację określonych regionów genomu, ułatwia regulację transkrypcji i promuje modyfikacje epigenetyczne (Brocken i in., 2018).
Czynnik transkrypcyjny ZEB1 (zinc finger E-box wiążący homeoboks 1) odgrywa szczególną i kluczową rolę w mediacji przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), procesu komórkowego zachodzącego podczas rozwoju embrionalnego, naprawy tkanek i progresji nowotworu. Obejmuje on transformację komórek nabłonkowych w komórki mezenchymalne, co prowadzi do zmian w morfologii komórek, ich ruchliwości, inwazyjności itp. (Wu i in., 2020). ZEB1 hamuje wiele markerów nabłonkowych, takich jak E-kadheryna i okludyna, które odpowiadają za utrzymanie adhezji międzykomórkowej i polarności komórek nabłonkowych w raku piersi z potrójnym rakiem piersi (TNBC) (Moreno-Bueno i in., 2008). Ponadto ZEB1 aktywuje pewne markery, takie jak N-kadheryna, wimentyna i fibronektyna (Konradi i in., 2014), a także reguluje geny zaangażowane w przebudowę cytoszkieletu, takie jak GTPazy Rho i metaloproteinazy macierzy (MMP) (Huang). i in., 2014). 2022), ponadto wpływa również na różne szlaki sygnałowe, takie jak transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β), sygnalizację Wnt itp., promując w ten sposób inwazję guza i przerzuty w TNBC (Chen i in., 2016). Liczne badania i dowody naukowe wskazują, że ZEB1 ma duży potencjał jako cenny środek do wykrywania i interwencji terapeutycznej TNBC. W niedawnym badaniu Waryah i in. wykorzystali model TNBC i osiągnęli całkowitą supresję ZEB1 przez dCas9. Zaobserwowano zatem bardzo wysoką specyficzność i niemal całkowite zahamowanie ZEB1 w warunkach in vivo (Waryah i in., 2023).
CRISPR/Cas12 to narzędzie do edycji genów o nazwie CRISPR/Cpf1. Wywodzi się z systemu CRISPR/Cas, gdzie termin Cas12 odnosi się do białka 12 związanego z CRISPR (Bharathkumar i in., 2022), które jest całkowicie podobne do Cas9. Jedyną różnicą jest to, że zawiera białko Cas12. W porównaniu z Cas9, Cas12 posiada pewne unikalne funkcje, takie jak generowanie lepkich końcówek podczas procesu edycji genów, podczas gdy Cas9 generuje tępe końcówki (Wang i in., 2021). Ta właściwość Cas12 przyczynia się do jego specyficznej technologii manipulacji DNA. Jako białko zdolne do precyzyjnego rozpoznawania i cięcia docelowego DNA, charakteryzuje się ono niezwykłą wszechstronnością, co czyni je skutecznym narzędziem w wielu zastosowaniach, w tym w edycji genów (Pickar-Oliver i Gersbach, 2019).
Podobnie jak inne warianty CRISPR, CRISPR/Cas12 jest również zdolny do wyłączania lub aktywowania genów w TNBC, celując w geny odgrywające ważną rolę w jego patogenezie lub odpowiedzi na leczenie (Yang i Zhang, 2023). Aby to osiągnąć, opracowano przewodnik RNA (gRNA), który kieruje Cas12 do genu docelowego. Po związaniu się Cas12 z genem docelowym, powoduje on pęknięcia dwuniciowe DNA i aktywuje mechanizmy naprawy DNA. Podczas procesu naprawy mogą zostać włączone nieprawidłowe nukleotydy, co prowadzi do mutacji genów i utraty ich funkcji (Zhang i in., 2021a). Ponadto, ulepszona wersja enzymu Cas12 (zwana dCas12) została również wykorzystana do aktywacji genów. Połączenie go z aktywatorem transkrypcji umożliwia indukcję niektórych genów, a tym samym ich aktywację. Technologia ta ma ogromny potencjał w promowaniu aktywacji genów supresorowych nowotworów (Sultan i in., 2022).
Edycja prime to nowo opracowana i niezwykle zaawansowana technologia edycji genomu. Umożliwia ona bardzo precyzyjną modyfikację DNA organizmu (Chen i Liu, 2023). Edycja prime odbywa się poprzez integrację dwóch głównych komponentów: zmodyfikowanego enzymu CRISPR/Cas9 i odwrotnej transkryptazy. Rolą enzymu CRISPR/Cas9 jest selektywne namierzanie precyzyjnych miejsc w genomie, podczas gdy odwrotna transkryptaza pomaga w dokładnej modyfikacji DNA w miejscu docelowym (Hassan i in., 2021). W mechanizmie edycji primerów, pierwszym krokiem jest stworzenie pegRNA (ang. primer editing guide RNA) (Standage-Beier i in., 2021). Zawiera on sekwencję docelową i matrycę RNA odpowiadającą pożądanemu miejscu edycji w docelowym DNA. PegRNA jest następnie wprowadzany do komórek docelowych wraz z nukleazą edycyjną primerów (PE2). PE2 to białko fuzyjne składające się z enzymu Cas9, odwrotnej transkryptazy i adaptera edycji starterów (Martín-Alonso i in., 2021). Wewnątrz komórki kompleksy pegRNA i PE2 poszukują specyficznego DNA, które chcą zmodyfikować. Enzym Cas9 tnie DNA i tworzy matrycę składającą się z pojedynczych nici (Choi i in., 2022). Odwrotna transkryptaza używa tej matrycy do przygotowania DNA do edycji. Oprócz kopiowania DNA zawarte są również instrukcje dotyczące edycji matrycy RNA. Na koniec nowo utworzona nić DNA jest używana jako matryca do naprawy pęknięcia w DNA, co skutkuje zmienioną sekwencją DNA zawierającą pożądaną modyfikację (Ochoa-Sanchez i in., 2021). Mechanizmy edycji starterów mogą prowadzić do rozległych mutacji w genach. Mogą one celować w mutacje punktowe, insercje, delecje, a nawet zastąpienia genów (Anzalone i in., 2019; Chen i Liu, 2023). Edycja podstawowa oferuje szereg zalet w porównaniu z poprzednimi technologiami edycji genomu. Należą do nich zwiększona dokładność, redukcja efektów pozacelowych oraz możliwość edycji DNA bez konieczności polegania na pęknięciach dwuniciowych DNA (Anzalone i in., 2020).
Technologia CRISPR/Cas9 została pierwotnie opracowana w celu ochrony bakterii przed transferem plazmidów i infekcją fagową, a później została przekształcona w skuteczne narzędzie do ukierunkowanego DNA opartego na RNA do edycji genomu (Jiang i Doudna, 2017). Ponadto doniesiono, że system CRISPR/Cas9 jest obecny odpowiednio w 50% i 87% genomów bakterii i archeonów (Ishino i in., 2018). CRISPR/Cas9 to potencjalne narzędzie do usuwania, insercji i korekcji dowolnej nieprawidłowej sekwencji genetycznej w trybach in vivo i in vitro (Sabit i in., 2021). Ponadto wykazano, że CRISPR/Cas9 jest częścią adaptacyjnego układu odpornościowego ze względu na swoją specyficzność dla interesujących genów docelowych (Chen i Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 składa się z Cas9 i pojedynczego RNA przewodnikowego (sgRNA). Cas9 to endonukleaza złożona z wielu komponentów białkowych. Ponadto Cas9 ma unikalne właściwości strukturalne i konformacyjne (Pacesa i in., 2022), ponieważ składa się z dwóch płatów: rozpoznającego (REC) i nukleazy (NUC). Płat REC jest dodatkowo podzielony na trzy regiony: REC1, REC2 i helisy mostkowe (Cromwell i in., 2018). NUC składa się z trzech płatów: RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH oraz domeny interakcji z motywem sąsiadującym z protospacerem (PAM) (ryc. 1) (Song i in., 2016). sgRNA składa się z dwóch komponentów, w tym RNA CRISPR (crRNA) i transkodującego małego RNA (tracer RNA) (ryc. 1). SgRNA łączy białko Cas9 z koneksynami, tworząc aktywny kompleks, znany również jako kompleks efektorowy (Richter i in., 2012). crRNA to para zasad 18–20 nukleotydów, która odgrywa kluczową rolę w rozpoznawaniu docelowych sekwencji DNA. Ponadto crRNA łączy się z docelowym DNA, a tracrRNA działa jak rusztowanie dla nukleazy Cas9, aby związać docelowe DNA (Manghwar i in., 2019). Z drugiej strony, sekwencja PAM ma 3 nukleotydy, co potwierdza, określa i pośredniczy w wiązaniu kompleksu efektorowego do DNA. Podjednostki kompleksu białkowego Cas9 RuvC i HNH mają aktywność katalityczną (Richter i in., 2012; Asmamaw i Zawdie, 2021). Domena nukleazy HNH podjednostki Cas9 rozszczepia nić DNA związaną z crRNA. Domena nukleazy RuvC rozszczepia inne nici DNA i powoduje pęknięcia dwuniciowe (DSB), po czym aktywowane są dwa różne mechanizmy naprawy pęknięć DNA (Jiang i Doudna, 2017) (ryc. 1).
Rysunek 1. Przegląd CRISPR/Cas9 (A). Składniki systemu CRISPR/Cas9: (i). Endonukleaza Cas9 jest odpowiedzialna za cięcie docelowej sekwencji DNA, (ii) pojedynczy przewodnik RNA (sg) powstający w wyniku fuzji chimer crRNA i tra-crRNA. (dwa). Cas9 zawiera kilka składników, takich jak Rec I, Rec II, płat NUC (HNH i Ruv C są podskładnikami) oraz domenę interakcji PAM (C) z odpowiadającymi im funkcjami. Kompleks białkowy CRISPR/Cas9 rozszczepia sekwencje DNA na formy niekomplementarne i komplementarne (D). CRISPR/Cas9 edytuje genom w trzech etapach: rozpoznanie, cięcie i naprawa. Zaprojektowany sg-RNA kieruje Cas9 i rozpoznaje pożądaną sekwencję poprzez komplementarny składnik crRNA. Cas9 rozpoznaje sekwencję PAM w pozycji 5′-NGG-3′ i topi DNA, tworząc hybrydę DNA-RNA i aktywując rozszczepienie. Domena HNH Cas9 rozszczepia nić komplementarną, a domena RuvC nić niekomplementarną. CRISPR/Cas9 naprawia dsDNA, rozszczepiając je na dwa sposoby: poprzez łączenie niehomologicznych końców (NHEJ) i naprawę kierowaną homologią (HDR). NHEJ naprawia dwuniciowe DNA w przypadku braku obcego homologicznego DNA poprzez proces enzymatyczny – mechanizm podatny na błędy, który może wstawiać lub usuwać losowe sekwencje DNA. HDR jest bardzo specyficzny i wymaga homologicznych matryc DNA.
Szlaki naprawcze CRISPR/Cas9 obejmują mechanizmy łączenia niehomologicznych końców (NHEJ) i naprawy kierowanej homologią (HDR). NHEJ jest podatny na błędy, ponieważ obejmuje insercję lub delecję i nie wymaga żadnego wzorca podczas naprawy. Wykorzystuje losowe nukleotydy do generowania standardowych białek (Abbasi i in., 2021). Ten system naprawczy składa się z czterech kompleksów, takich jak kompleks KU, kompleks białkowy typu 4 (XRCC-4), enzym przetwarzający końce DNA oraz kinaza białkowa DNA-PKcs (Abbasi i in., 2021). Kompleks białkowy KU ma dwie podjednostki, Ku 70 i Ku 80, i odgrywa ważną rolę w mechanizmie NHEJ, ponieważ mechanizm naprawy jest inicjowany przez wiązanie dwóch podjednostek (Ku 70 i Ku 80) do tępych lub prawie tępych końców docelowego DNA (Abbasi i in., 2021), służąc jako rusztowanie do rekrutacji innych czynników związanych z NHEJ do miejsca uszkodzenia (Yang i in., 2020). XRCC-4 i ligaza DNA składają się odpowiednio z 334 i 911 aminokwasów, a kompleks XRCC4-ligaza DNA IV stymuluje ligację końców DNA (Chatterjee i in., 2015). Enzym przetwarzający końce DNA, znany również jako kinaza polinukleotydowa 3′-fosforan, jest enzymem przetwarzającym końce DNA. Może usunąć grupę 3′P w DNA i fosforylować grupę 5′OH podczas naprawy DSB. Obejmuje również naprawę pęknięć jednoniciowych (SSB) z wykorzystaniem ścieżki naprawy SSB (Chatterjee i in., 2015). Kinaza białkowa DNA-PKcs to kinaza białkowa zależna od DNA, która składa się z podjednostki katalitycznej kinaz PIKK (kinaz powiązanych z kinazą fosfatydyloinozytolu 3) i rodziny z mutacją ataksji-teleangiektazji (ATM), a także ATR powiązanych z ATM i Rad3. pęknięć jednoniciowych (DSB) i pęknięć jednoniciowych (Yue i in., 2020; Peng i in., 2016).
HDR jest dokładniejszym i bardziej odpowiednim mechanizmem naprawy, ponieważ informacja jest kopiowana z wykorzystaniem nienaruszonej formy homologicznego dupleksu DNA, chociaż wymaga obecności chromatyd siostrzanych. Dzieje się to w fazie S/G2 cyklu komórkowego ssaków. HDR występuje głównie u drożdży, ale NHEJ ma kluczowe znaczenie u ssaków (Burma i in., 2006; Abbasi i in., 2021). Pełny mechanizm naprawy przedstawiono na rysunku 1.
Ponieważ TNBC jest spowodowany nieprawidłowościami genetycznymi i epigenetycznymi, korekcja złośliwych nieprawidłowości genomicznych/epigenomicznych za pomocą CRISPR/Cas9 może być rozsądnym podejściem terapeutycznym (Chen i in., 2019). Ponadto, niektóre czynniki transkrypcyjne zaangażowane w komórkowo-specyficzną regulację transkrypcji mogą wykazywać unikalne cechy komórek nowotworowych, co sugeruje, że regulacja transkrypcji może być doskonałym podejściem w leczeniu raka (Drost i in., 2017). Wykorzystanie tych molekularnych cech nowotworów, takich jak defekty genetyczne, epigenetyczne i transkrypcyjne, do rozwoju leków może poprawić wyniki kliniczne i obniżyć koszty badań przesiewowych. CRISPR to potencjalne narzędzie do edycji genów, które może nie tylko wykrywać i identyfikować rakotwórcze cele genomiczne, ale także służyć do edycji, tłumienia i epigenetycznej modyfikacji onkogenów w komórkach ludzkich (Tabela 1) (Ahmed i in., 2021). Przeprowadzono kilka badań przesiewowych CRISPR w celu poszukiwania genów związanych z supresorami nowotworów, onkogenami i lekoopornością. Wykorzystanie CRISPR/Cas9 do edycji różnych onkogenów TNBC przedstawiono na rysunku 2.
Rycina 2. Edycja genów różnych onkogenów TNBC z wykorzystaniem CRISPR/Cas9, skutkująca zahamowaniem wzrostu guza i przerzutów. Do onkogenów tych należą CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 i CXCR7, Crypto1, ROR1 i ST8SIA, które są zaangażowane w występowanie i przerzuty TNBC.
Migracja, inwazja i transformacja nabłonkowo-mezenchymalna komórek nowotworowych (EMT) są związane z ITGA9. Wcześniejsze badania wykazały, że ITGA9 odgrywa kluczową rolę w szlaku Notch i odgrywa interesującą rolę w przerzutach mięśniakomięsaka prążkowanokomórkowego (Molist i in., 2020). Ponadto stwierdzono, że ITGA9 jest ściśle związany z rokowaniem pacjentów w przypadku kilku typów nowotworów, w tym raka piersi (Wang Z. i in., 2019). Co więcej, analiza bioinformatyczna ITGA9 wykazała, że ​​jego ekspresja w TNBC była istotnie wyższa niż w innych podtypach raka piersi. Podwyższony poziom ITGA9 jest związany z przerzutami i nawrotem u pacjentów z TNBC. Wyeliminowanie ITGA9 metodą CRISPR/Cas9 spowodowało uzyskanie właściwości podobnych do komórek macierzystych raka (CSC), angiogenezę guza, wzrost guza i zmniejszenie przerzutów poprzez promowanie degradacji β-kateniny w TNBC (Wang Z. i in., 2019).
Crypto-1 należy do rodziny TGF-β i jest krytyczny dla wczesnej embriogenezy, utrzymania komórek macierzystych i przerzutów nowotworowych (Ishii i in., 2021). Znany również jako Tdgf-1, jest onkogennym białkiem sygnałowym zakotwiczonym w GPI, zaangażowanym w regulację tworzenia prymitywnej smugi, mezodermy i endodermy, a także w ustalanie asymetrii lewej/prawej w rozwoju narządów ciała podczas embriogenezy (Zhang i in., 2021b). Ponadto wykazano, że Cripto-1 bierze udział w przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT) jako marker komórek macierzystych (Zhang i in., 2021b). EMT jest krytyczny nie tylko dla różnych procesów, takich jak rozwój embrionalny, zwłóknienie i gojenie się ran, ale także dla inwazji i przerzutów nowotworowych. Ponadto wykazano, że Cripto-1 oddziałuje z czterema receptorami Notch i wzmacnia ich dojrzewanie potranslacyjne (Brandstadter i Maillard, 2019). Wiadomo, że szlak sygnałowy Notch uczestniczy w utrzymaniu komórek ludzkiego raka piersi. Badania wykazały, że eliminacja Crypto-1 za pośrednictwem CRISPR/Cas9 hamuje wzrost i przerzuty nowotworu. Dlatego Crypto-1 może stać się ważnym celem terapeutycznym w leczeniu TNBC (Castro i in., 2015).
Białko XCL12 i jego receptor chemokinowy CXC (CXCR4 i CXCR7) odgrywają różne role w proliferacji, wzroście, migracji i inwazji komórek nowotworowych (Wu i in., 2015). Chemoreceptory te są powiązane z rozwojem TNBC poprzez liczne szlaki sygnałowe zarówno w modelach in vivo, jak i in vitro (Wu i in., 2015). Ponadto, aktywacja CXCR4 i CXCR7 wiąże się z większą podatnością na przerzuty i gorszym rokowaniem w TNBC (Karn i in., 2022). Dlatego też, wybicie CXCR4 i CXCR7 może stać się skutecznym genem docelowym leków w leczeniu raka piersi, w tym TNBC. Badanie przeprowadzone przez Yang i in. Yang i in. (2019) zastosowali CRISPR/Cas9 do jednoczesnego wyłączenia genów CXCR4 i CXCR7 i odkryli, że proliferacja, wzrost, migracja i inwazja TNBC zostały znacząco zahamowane (Yang i in., 2019).
W tkankach raka piersi zaobserwowano zwiększone poziomy miR-3662, onkogenu TNBC (Yi i in., 2022). Wykazano, że obniżenie ekspresji miR-3662 hamuje wzrost guza i przerzuty raka piersi zarówno in vivo, jak i in vitro (Agarwal i Gupta, 2021). HBP-1 jest silnym inhibitorem szlaku sygnałowego Wnt/-katenina i prawdopodobnie odpowiada za wzrost komórek TNBC zależny od miR-3662. Niedawno Yi i in. odkryli, że oś miR-3662-HBP1 reguluje szlak sygnałowy Wnt/-katenina w komórkach TNBC (Yi i in., 2022). Ze względu na specyficzną dla nowotworów ekspresję miR-3662 może być potencjalnym celem terapeutycznym w leczeniu TNBC. Zatem obniżenie ekspresji miR-3662 za pomocą CRISPR/Cas9 może okazać się doskonałym podejściem do opracowywania nowych leków do leczenia TNBC.
UBR5 to nukleofosfoproteina o masie cząsteczkowej 300 kDa, która została zidentyfikowana jako kluczowy regulator nowotworzenia, przerzutów i odpowiedzi immunologicznej w różnych nowotworach (Shearer i in., 2015; Fu i in., 2023). Wykazano, że UBR5 jest silnie podwyższony w próbkach TNBC i stymuluje funkcję receptora estrogenowego alfa (ERα) poprzez indukowanie proliferacji poprzez aktywność ligazy ubikwitynowej (Bolt i in., 2015). Badania sekwencjonowania całego eksomu pierwotnych próbek TNBC również wykazały zwiększoną ekspresję UBR5, co sugeruje jego rolę w rozwoju TNBC. Ponadto, delecja UBR5 wywołana przez CRISPR/Cas9 wykazała znaczące zahamowanie przerzutów i wzrostu TNBC w eksperymentalnych modelach mysich. Ponadto, włączenie UBR5 do modelu myszy dzikiego typu przywróciło jego pełną funkcjonalność, podczas gdy tego efektu nie obserwowano w inaktywowanych szczepach zmutowanych (Liao i in., 2017). Brak UBR5 jest związany ze zwiększoną apoptozą, martwicą i zahamowaniem wzrostu guza w TNBC z powodu słabej angiogenezy. Z powodu utraty UBR5, rozprzestrzenianie się guza do odległych narządów jest zmniejszone, a UBR5 indukuje nieprawidłowy EMT głównie poprzez zmniejszenie ekspresji E-kadheryny (Zhang i Weinberg, 2018). Niedawno wykazano, że UBR5 jest bardzo ważnym czynnikiem w indukowanej przez IFN-γ transkrypcji PDL1 w TNBC z powodu braku aktywności ubikwitynacyjnej E3. Analiza transkryptomu RNA wykazała, że ​​UBR5 może mieć systemowy wpływ na geny związane ze szlakiem IFN-γ i promować transaktywację PDL1 poprzez zwiększanie poziomów aktywacji kinazy białkowej RNA (PKR) oraz jej przekaźników sygnału i aktywatorów. Transkrypcja 1 (STAT1) i czynnik regulujący interferon 1 (IRF1). Jednakże, skojarzona ablacja ekspresji UBR5 i PD-L1 za pośrednictwem CRISPR/Cas9 ma synergistyczny efekt terapeutyczny w porównaniu z każdą z tych blokad osobno, wywierając znaczący wpływ na mikrośrodowisko guza (Wu i in., 2022). Zatem CRISPR/Cas9 może być ważnym narzędziem hamowania funkcji UBR5, a tym samym hamowania przerzutów i wzrostu guza po raku piersi (TNBC).
ROR1 to białko transbłonowe typu I, które ulega ekspresji w trakcie rozwoju nowotworowego i embrionalnego i zostało zidentyfikowane jako białko onkopłodowe (Nicholas Borcherding, 2014). Inwazyjne zachowanie różnych ludzkich nowotworów jest związane z nadmierną ekspresją ROR1. Obiecujące wyniki uzyskano w badaniach in vivo i in vitro z udziałem związków terapeutycznych ukierunkowanych na ROR1 (Chien i in., 2016). Podwyższone poziomy mRNA ROR1 w biopsjach tkanki piersi powiązano również z agresywnymi guzami piersi typu basal-like (BL) i ich migracją do innych części ciała. Ponadto, nadekspresja ROR1 została zidentyfikowana jako marker prognostyczny rozwoju TNBC (Chien i in., 2016). Jednakże wyciszenie ROR1 za pomocą CRISPR/Cas9 w celu zahamowania wzrostu i przerzutów TNBC byłoby skuteczną strategią.
Proces sialilacji obejmuje dodanie kwasu sialowego do glikokoniugatów, co jest katalizowane przez sialilotransferazy (ST). ST8SIA1 należy do rodziny ST i odgrywa ważną rolę w patogenezie różnych chorób, takich jak białaczka limfocytowa i rak jelita grubego (Chang i in., 2018). Analiza sekwencji RNA pokazuje, że ST8SIA1 jest silnie ekspresjonowany w tkance piersi u pacjentów z TNBC i jest dodatnio skorelowany z mutacjami w genie supresorowym nowotworu p53, który może przyczyniać się do patogenezy TNBC (Battula i in., 2017). Ponadto ST8SIA1 bierze udział w przerzutach i nawrotach TNBC, co sugeruje, że odgrywa ważną rolę w występowaniu i rozwoju TNBC. W modelu in vitro TNBC wykazano, że obniżenie ekspresji ST8SIA1 przez CRIPSR/Cas9 blokuje wzrost i przerzuty (Battula i in., 2017). Sugeruje to, że CRISPR/Cas9 może być ważnym narzędziem hamowania funkcji onkogenu ST8SIA1 w leczeniu TNBC.
NAT1 to enzym metaboliczny, który katalizuje powstawanie związków ksenobiotycznych fazy II i jest ekspresowany w prawie wszystkich ludzkich tkankach. NAT1 może wykorzystywać kofaktor folian do kierowania acetylo-CoA (acetylo-CoA) nawet w przypadku braku substratu w postaci aminy aromatycznej (Stepp i in., 2015; Laurieri i in., 2014). Badania wykazały, że NAT1 reguluje funkcję metaloproteinazy macierzy 9 (MMP9) w modelach komórek raka piersi i chroni przed reaktywnymi formami tlenu (ROS) podczas głodowania glukozowego (Wang i in., 2018). Wykazano, że usunięcie NAT1 hamuje kompleks dehydrogenazy pirogronianowej, co prowadzi do dysfunkcji mitochondriów (Wang L. i in., 2019). Ponadto, różne inne doniesienia wykazały, że hamowanie NAT1 za pomocą małych cząsteczek i wyciszania siRNA może zmniejszyć inwazyjność i proliferację komórek raka piersi (Stepp i in., 2018). Niedawno CRISPR/Cas9 zastosowano do supresji NAT1 w linii komórkowej raka piersi MDA-MB-231, wpływając na metabolizm komórkowy w zależności od poziomu jego ekspresji. Badanie to wykazało również, że NAT-1 ma kluczowe znaczenie dla progresji i przerzutów TNBC (Carlisle i in., 2020).
Skoordynowana transkrypcja onkogenów jest regulowana przez superwzmacniacze, czynniki transkrypcyjne i kofaktory (Hnisz i in., 2015). Ponadto do regulacji transkrypcji niezbędna jest grupa kinaz zależnych od cyklin (CDK), takich jak CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 i CDK13. Wśród nich CDK7 bierze udział w fosforylacji polimerazy RNA II, co jest niezwykle istotne dla inicjacji i ekspansji transkrypcji onkogenów w patogenezie TNBC. W przełomowym badaniu, delecja CDK7 przez CRISPR/Cas9 zahamowała TNBC, co wskazuje na zależność patogenezy TNBC od CDK7 (Wang Y. i in., 2015).
Badania wykazały, że mutacje w genie MYC i RBP (białko wiążące RNA) mogą prowadzić do apoptozy, podczas gdy mutacje pojedynczych genów w genie MYC lub RBP nie wpływają na wzrost komórek nowotworowych (Einstein i in., 2021). Ponad 1000 RBP w ludzkim genomie zostało przebadanych za pomocą biblioteki opartej na CRISPR/Cas9. Spośród nich 57 RBP okazało się krytycznych dla wzrostu komórek nowotworowych o bardzo podwyższonym poziomie MYC (Wheeler i in., 2020). Ponadto YTHDF2 odgrywa ważną rolę w utrzymaniu wzrostu komórek TNBC i zmniejsza ilość metylowanych transkryptów podczas transkrypcji i translacji na wysokim poziomie w komórkach nowotworowych o wyższej ekspresji MYC. Ponadto YTHDF2 nie jest niezbędny dla komórek nowotworowych, które są mniej zależne od podwyższonego poziomu MYC w przedłużaniu przeżycia pacjentów z TNBC (Einstein i in., 2021), co sugeruje, że może być potencjalnym celem terapeutycznym dla leków mogących pokonać TNBC.
Białka palców cynkowych (ZNF) stanowią około 1% całkowitego genomu człowieka. Badania wykazały, że ZNF może regulować proliferację komórek w różnych nowotworach, takich jak rak wątroby, rak piersi i rak jelita grubego (Zhang W. i in., 2021; Li i in., 2017). Biblioteki wygenerowane metodą CRISPR knockout zostały wykorzystane do przeszukiwania różnych genów supresorowych nowotworów (TSG) w komórkach raka piersi (Shalem i in., 2014). Od tego czasu badanie transkryptomiczne komórek raka piersi z usuniętym genem CRISPR/Cas9 ZNF319 wykazało, że ZNF319 jest genem supresorowym nowotworów, który zmniejsza proliferację raka piersi, a zatem uczestniczy w różnych potencjalnych mechanizmach sygnałowych i innych funkcjach biologicznych (Wang L. i in., 2022).
Ferroptoza to rodzaj programowanej śmierci komórki, która jest zależna od obecności żelaza. Wiadomo, że na rozwój ferroptozy wpływa obecność nadtlenków lipidów. Ponadto donoszono, że PKCβII wykazuje wczesną peroksydację lipidów, a zwiększona peroksydacja lipidów jest związana z ferroptozą. Przeszukiwanie biblioteki inhibitorów kinazy zależnych od CRISPR/Cas9 wykazało, że PKCβII bierze udział w procesie peroksydacji lipidów, który jest krytyczny dla ferroptozy w komórkach MDA-MB-231 (Zhang i in., 2022). Sugeruje to zatem, że wybicie PKCβII przez CRISPR/Cas9 może być potencjalnym celem genu supresorowego w leczeniu chorób związanych z ferroptozą (Zhang i in., 2022).
Uważa się, że lekooporność jest przyczyną około 90% zgonów pacjentów onkologicznych i stanowi jedno z głównych wyzwań w leczeniu nowotworów (Bukowski i in., 2020). Wyniki wskazują, że wystarczająca liczba genów związanych z wypływem leków, naprawą DNA, apoptozą i różnymi szlakami sygnalizacji komórkowej jest powiązana z lekoopornością (Haider i in., 2020). Wśród nich kilka genów zostało wykorzystanych w narzędziach CRISPR/Cas9 i wykazało obiecujące rezultaty w zmniejszaniu lekooporności i zwiększaniu skuteczności leczenia przeciwnowotworowego (Vaghari-Tabari i in., 2022). Ponadto biblioteki przesiewowe CRISPR/Cas9 o wysokiej przepustowości zostały powiązane z modyfikacją funkcji potencjalnych celów genów oporności na leki (Shalem i in., 2015). Aby zidentyfikować geny oporności na paklitaksel, zastosowano sekwencjonowanie RNA połączone z przesiewem biblioteki sgRNA w całym genomie w celu zidentyfikowania ośmiu genów kandydujących, w tym deacetylazy histonowej 9 (HDAC9), które są związane z opornością na leki u pacjentów z nawracającym TNBC (B i in., 2020). W innym badaniu zaobserwowano zwiększoną ekspresję kinazy białkowej diseryny/treoniny i tyrozynowej (DSTYK) podczas przeżycia pacjentów z TNBC leczonych lekami przeciwnowotworowymi. Ponadto, wyciszenie DSTYK za pomocą CRISPR/Cas9 znacząco zwiększyło apoptozę lekoopornych komórek nowotworowych in vitro (komórki SUM102PT i komórki MDA-MB-468) oraz w modelu TNBC in vivo (Ogbu i in., 2021).
Chociaż w przypadku TNBC występuje nieprawidłowa aktywacja szlaku MAPK, kliniczny efekt terapii ukierunkowanych na MEK jest niewielki. Badanie biblioteki genomowej CRISPR/Cas9 wykazało, że hamowanie PSMG2 (chaperonu 2 w procesie składania proteomu) uwrażliwia komórki TNBC BT549 i MB468 na inhibitor MEK AZD6244. Obniżenie ekspresji PSMG2 za pomocą CRISPR/Cas9 zaburzyło normalną funkcję proteasomu, prowadząc do autofagicznego rozkładu PDPK1, co dodatkowo poprawiło komórki nowotworowe w mysich modelach TNBC indukowanych przez AZD6244 (inhibitor MEK) i MG132 (inhibitor proteasomu). W związku z tym inhibitory proteasomu i kinazy MAP (MEK) można podawać synergistycznie w celu zmniejszenia proliferacji komórek nowotworowych (Wang X. i in., 2022).
CRISPR/Cas9 został również użyty do przesiewu w celu wykrycia utraty funkcji genu prowadzącej do oporności na TNBC (Shu i in., 2020). Ge i in. wyjaśnili mechanizm lekooporności komórek nowotworowych leczonych JQ1, inhibitorem bromodomeny BET (BBDI), w TNBC. Używając CRISPR/Cas9, odkryli, że usunięcie genu rb1 spowodowało, że TNBC stał się oporny na lek przeciwnowotworowy JQ1. Dlatego funkcja rb1 jest ważna w odpowiedzi na leki JQ1 w TNBC. Donieśli również, że paklitaksel jest inhibitorem kinazy/mikrotubul CDK4/6, a jego połączenie z BBDI, takimi jak JQ1, może zapewnić obiecujące odpowiedzi terapeutyczne na lekooporne TNBC (Ge i in., 2020).
Donoszono, że krajobraz transkrypcyjny długiego niekodującego RNA (lncRNA) jest odpowiedzialny za oporność na terapię neoadjuwantową w TNBC. Badanie to wykazało, że pięć różnych transkryptów lncRNA MALAT1 jest silnie ekspresjonowanych w TNBC. Ponadto, delecja MALAT1 za pośrednictwem CRISPR/Cas9 zwiększyła wrażliwość komórek BT-549 z TNBC na paklitaksel i doksorubicynę, co sugeruje potencjalną rolę oporności na MALAT1 w TNBC (Shaath i in., 2021).
Mutacje w genie BRCA1 (BRCA1m) są heterogeniczne i dlatego trudne do wykrycia. Celowanie w PARP1 (polimerazę poli(ADP-rybozy)), syntetycznego letalnego partnera BRCA1, może zwiększać chemiowrażliwość na leki stosowane w raku piersi typu TNBC. Zastosowanie CRISPR/Cas9 wykazało, że usunięcie PARP1 zwiększyło wrażliwość leków przeciwnowotworowych, takich jak doksorubicyna, gemcytabina i docetaksel, na komórki TNBC z mutacją mBRCA1, co sugeruje, że PARP1 jest również zaangażowany w lekooporność w TNBC (Vaghari-Tabari i in., 2022). Wiadomo, że mutacje w genach supresorowych nowotworów BRCA1 lub BRCA2 zwiększają prawdopodobieństwo rozwoju raka piersi u ludzi. Leczenie tych pacjentów wymaga stosowania inhibitorów PARP. Ponadto wykazano, że eliminacja czynnika ratunkowego nukleotydów DNPH1 za pomocą CRISPR/Cas9 może usunąć toksyczny monofosforan nukleotydu 5-hydroksymetylodeoksyurydyny (hmdU), wzmacniając w ten sposób odpowiedź komórek z niedoborem genu BRCA na wrażliwość na inhibitory PARP (Fugger i in., 2021). Zatem inhibitory CRISPR/Cas9 i PARP1 mogą stać się ważną strategią leczenia TNBC.
Gen glikoproteiny penetrującej (P-gp) to gen oporności wielolekowej, który jest na ogół nadregulowany w około 41% przypadków TNBC (Sun i in., 2020). Wypływ leku indukowany przez P-gp został zidentyfikowany jako kluczowy regulator oporności na leki w raku piersi. Inhibitory P-gp wykazały zwiększoną wrażliwość na leki przeciwnowotworowe w raku piersi (Famta i in., 2021). Zatem ablacja lub supresja P-gp i inhibitorów P-gp za pośrednictwem CRISPR/Cas9 może być bardzo ważną metodą pokonywania oporności na leki w TNBC.
Wiadomo, że transporter kasety wiążącej ATP G2 (ABCG2) powoduje lekooporność w TNBC (Palasuberniam i in., 2015), chociaż obecnie brak doniesień na temat związku między wyciszaniem genu CRISPR/Cas9 i ABCG2 a inaktywacją genu supresora nowotworu. PTEN może nasilać aktywację ABCG2 (Palasuberniam i in., 2015) (Deepak Singh i in., 2021). Dlatego zastosowanie CRISP/Ca9 w celu usunięcia ABCG2 i połączenie go z inhibitorem ABCG2 może być odpowiednią metodą leczenia przezwyciężenia lekooporności w TNBC. W tabeli 2 wspomniano o CRISPR/Cas9 ukierunkowanym na wszystkie geny oporności.
Tabela 2. CRISPR/Cas9 oddziałuje na różne geny oporności na TNBC, aby uwrażliwić komórki na leki przeciwnowotworowe.
Biblioteki CRISPR/Cas9 to potencjalne narzędzia do przesiewowego badania mutacji genów związanych z patogenezą nowotworów (Chan i in., 2022). Ta metoda przesiewowa obejmuje cztery etapy, takie jak: (a) konstrukcja biblioteki, (b) transdukcja lentiwirusowa, (c) przesiew fenotypowy i (d) analiza genu docelowego. Chociaż w przypadku TNBC występuje nieprawidłowa aktywacja szlaku MAPK, rokowanie kliniczne terapii celowanej z użyciem MEK u pacjentów z TNBC z mutacjami w genach supresorowych, takich jak PTEN, RB1 i TP53, jest bardzo niekorzystne.
Ponadto, w badaniu przesiewowym z wykorzystaniem CRISPR/Cas9, przetestowano najsilniejszą i najbardziej selektywną cząsteczkę – dehydrokatrol, który obficie występuje w ekstraktach z kwiatów i liści gwatemalskich – aby zrozumieć wpływ dehydrokatrol na MDA-MB-231. Mechanizmy selektywnej cytotoksyczności komórkowej. Charakterystyka macierzystości mezenchymalnej podtypów TNBC. To badanie przesiewowe oparte na CRISPR/Cas9 wykazało również, że HSD17B11, gen kodujący dehydrogenazę 17β-hydroksysteroidową typu 11, jest silnie ekspresjonowany w komórkach MDA-MB-231 i prowadzi do powstania dehydrofalkarinolu specyficznego dla tych komórek (Grant i in., 2020). Sugeruje to, że genomiczne badanie przesiewowe CRISPR/Cas9 ma duży potencjał w identyfikacji mechanizmów leżących u podstaw właściwości przeciwnowotworowych potencjalnych związków naturalnych.
Ponadto, podatność TNBC na raka została zbadana przy użyciu obiektywnego, ogólnogenomowego badania przesiewowego CRISPR/Cas9 in vivo, które wykazało powiązanie między szlakami onkogennymi i supresorowymi nowotworu. Doniesiono, że kluczowe składniki szlaków mTOR i Hippo odgrywają ważną rolę w regulacji nowotworu w TNBC. Ponadto badania wykazały, że farmakologiczne hamowanie mTORC1/2 i onkoproteiny YAP skutecznie hamuje patogenność TNBC przy użyciu modelu synergii lek-matryca in vitro oraz ksenograftów pochodzących od pacjentów in vivo. Ponadto, hamowanie mTORC1/2 za pośrednictwem Torin-1 nasila makropinocytozę, podczas gdy hamowanie YAP indukowane przez werteporfinę prowadzi do śmierci komórek TNBC. Podsumowując, wyniki te podkreślają siłę i solidność badań przesiewowych CRISPR in vivo w całym genomie w celu identyfikacji nowych i skutecznych metod leczenia TNBC (Dai i in., 2021).
Dysregulacja układu odpornościowego jest istotnym czynnikiem w nowotworzeniach. Komórki nowotworowe unikają eliminacji układu odpornościowego, omijając mechanizmy obronne, w tym zakłócając aktywność komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza i osłabiając układ odpornościowy. Dlatego też, wzmocnienie układu odpornościowego może być kluczowym podejściem do walki z nowotworami. Zastosowanie modyfikacji genów opartej na CRISPR/Cas9 pozwala rozwiązać szereg problemów związanych z dysfunkcją układu odpornościowego z różnych perspektyw. CRISPR/Cas9 został wykorzystany do poprawy odporności przeciwnowotworowej w raku piersi poprzez następujące ścieżki (Rysunek 3).
Rycina 3. Immunoterapia CRISPR/Cas9 ukierunkowana jest na komórki TNBC. Utrata CDK5 i wyciszenie ekspresji PDL1 i CD155 wzmacniają układ odpornościowy. Podobnie, utrata receptora A2AR i wyciszenie ekspresji receptorów TAA, takich jak HER2, mucyna 1 i TEM8, zwiększyły skuteczność limfocytów CAR-T w zabijaniu komórek nowotworowych. Badania przesiewowe limfocytów T z wykorzystaniem CRISPR/Cas9 wykazały, że zaburzenie aktywności kinazy p38 nasila aktywność przeciwnowotworową limfocytów T. Limfocyty T zmodyfikowane przez CRISPR/Cas9 zwiększają ekspresję receptora limfocytów T (TCR), co skutkuje zwiększeniem aktywności przeciwnowotworowej limfocytów T.
Celem immunoterapii jest stymulacja układu odpornościowego do ataku na komórki nowotworowe. Nadmierna ekspresja białek punktów kontrolnych układu odpornościowego zazwyczaj zapobiega reakcjom autoimmunologicznym, ale może pomóc nowotworom ich uniknąć (Topalian i in., 2015). Białka te zapobiegają reakcjom immunologicznym poprzez wiązanie się z receptorami na powierzchni komórek układu odpornościowego. Wiele białek punktów kontrolnych (takich jak CD155 i PD-L1) ukierunkowuje receptor PD-1 na komórkach układu odpornościowego i jest ekspresjonowanych w raku piersi, zwłaszcza TNBC (Li Y.-C. i in., 2020). Wyciszenie ekspresji PD-L1 lub jego receptora za pomocą CRISPR/Cas9 może stymulować układ odpornościowy do ataku na guzy TNBC (Yahata i in., 2019). Ponadto wykazano, że obniżenie ekspresji PD-L1 poprzez delecję CDK5 za pośrednictwem CRISPR/Cas9 hamuje wzrost guza in vitro i in vivo (Deng i in., 2020). Zahamowanie wzrostu w modelach raka piersi in vitro i in vivo sugeruje, że redukcja CD155 za pośrednictwem shRNA może mieć działanie terapeutyczne w przypadku raka piersi (Gao i in., 2018).
Limfocyty CAR T ekspresjonują receptory CAR, które rozpoznają antygeny związane z guzem (TAA) i mogą wykorzystywać wyciszanie ekspresji białek punktów kontrolnych do zwiększenia swojej aktywności (Li C. i in., 2020). Istnieją różne potencjalne cele terapii komórkami CAR T w raku piersi, w tym kilka TAA, takich jak HER2, mucyna 1 i TEM8 (Bajgain i in., 2018). Istnieją dowody na to, że limfocyty CAR T ukierunkowane na mezotelinę (nadmiernie ekspresjonowaną w komórkach TNBC BT-459) są skuteczniejsze w walce z rakiem, gdy PD-1 jest wyciszany za pomocą CRISPR/Cas9 (Hu i in., 2019). Jednak izolacja limfocytów T od pacjentów, a następnie ich edycja ex vivo jest procesem pracochłonnym i czasochłonnym. Chociaż uniwersalne limfocyty T mogą zmniejszyć wymagania izolacyjne, limfocyty T dawcy wyrażające ludzki antygen leukocytarny (HLA) klasy I i receptor limfocytów T (TCR) powinny zostać usunięte, aby zapobiec nieprawidłowościom przeszczep przeciwko gospodarzowi (Ren i in., 2017). , 2017a). Używając CRISPR/Cas9, HDR może jednocześnie wyeliminować TCR i HLA oraz wyłączyć gen kodujący CAR. Badania wykazały, że CRISPR/Cas9 można wykorzystać do wprowadzenia CAR anty-CD19 do locus TCR, tym samym skutecznie produkując CAR bez wyczerpywania limfocytów T (Dimitri i in., 2022). Opracowano technologie multipleksowe w celu generowania allogenicznych limfocytów CAR T przez jednoczesną eliminację TCR, beta-2-mikroglobuliny (B2M), podjednostki HLA-I i innych białek, takich jak PD-1 i CTLA-4, które mogą mieć większe właściwości przeciwnowotworowe. przeciwko TNBC (Eyquem i in., 2017; Liu i in., 2017; Ren i in., 2017b; Dimitri i in., 2022).
Wykorzystanie CRISPR/Cas9 może poprawić skuteczność komórek CAR-T. Wiadomo, że adenozyna ma właściwości immunosupresyjne i może zmniejszać odporność przeciwnowotworową poprzez blokowanie funkcji komórek T i aktywowanie receptorów adenozyny A2A (A2AR) (Vigano i in., 2019). Wyciszenie A2AR za pomocą CRISPR/Cas9 znacząco poprawiło skuteczność komórek CAR-T in vivo (Giuffrida i in., 2021). Wiadomo, że komórki T wykazują różne cechy fenotypowe, takie jak ekspansja komórkowa, różnicowanie, stres oksydacyjny i stres genomowy. Badania przesiewowe komórek T oparte na CRISPR/Cas9 ujawniły zaburzenie 25 różnych kinaz receptorów komórek T. Wykazano, że wśród nich usunięcie kinazy p38 zwiększa aktywność przeciwnowotworową komórek T, co wskazuje, że kinaza p38 jest kluczowym regulatorem regulacji komórek CAR-T (Gurusamy i in., 2020).
Limfocyty T można modyfikować genetycznie za pomocą CRISPR/Cas9 w celu wytworzenia receptorów TCR o wysokiej ekspresji. Przeniesienie genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T do pacjentów wykazało silniejszą aktywność przeciwnowotworową niż endogennych limfocytów T. W związku z tym endogenne receptory TCR mogą konkurować z genetycznie zmodyfikowanymi limfocytami T u pacjentów, co może wpływać na potencjał immunoterapii nowotworów. Aby rozwiązać ten problem, zastosowanie CRISPR/Cas9 do usunięcia endogennych TCR-β z komórek biorcy, a następnie przeniesienie limfocytów T TCR-β do pacjentów onkologicznych może wykazywać lepszą odpowiedź immunologiczną przeciwnowotworową bez konieczności rywalizacji płciowej endogennych TCR (Fan i in. 2018). Zatem, z wyjątkiem limfocytów T zmodyfikowanych za pomocą CRISPR, limfocyty TCR są tysiąc razy bardziej wrażliwe na antygeny nowotworowe niż normalne limfocyty T transdukowane za pomocą TCR. Ponadto, w różnych białaczkach, zmodyfikowane limfocyty T generowane przez γδ TCR+ CRISPR wykazują wyższą ekspresję limfocytów T CD4+ i CD8+ niż standardowy transfer TCR (Legut i in., 2018). Zatem zmodyfikowane limfocyty T generowane przez CRISPR/Cas9 mogą być skuteczną metodą immunoterapii w leczeniu TNBC.
Integryny to cząsteczki adhezji komórkowej obecne w błonach komórkowych i promujące wiązanie komórek z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) (Hamidi i Ivaska, 2018). Dysregulacja integryn jest związana z rozwojem i migracją nowotworów poprzez zmianę macierzy zewnątrzkomórkowej, co prowadzi do przeżycia komórek nowotworowych w krwiobiegu (Hamidi i Ivaska, 2018). Obniżenie ekspresji integryn za pomocą CRISPR/Cas9 spowalnia progresję guza, przerzuty i kolonizację w raku piersi z potrójnym rakiem piersi (TNBC). Wykazano, że obniżenie ekspresji integryny a5 (ITGA5) zmniejsza migrację i progresję komórek w innych nowotworach, takich jak rak płuc (Ju i in., 2017), co sugeruje, że integryna a5 może być również kluczowym czynnikiem w patogenezie raka piersi z potrójnym rakiem piersi (TNBC).
Generowanie myszy typu knockout przy użyciu tradycyjnych metod pozyskiwania komórek macierzystych zarodka (ES) jest pracochłonnym, czasochłonnym i nieefektywnym procesem. Dotarcie do komórek ES poprzez rekombinację homologiczną, wyhodowanie myszy chimerycznych, a następnie skrzyżowanie ich z myszami heterozygotycznymi w celu uzyskania homozygotycznego potomstwa zajmuje miesiące i lata. Stworzenie myszy z wieloma mutacjami genetycznymi wymaga złożonego krzyżowania. Jednak wiele problemów pojawia się podczas wykorzystywania myszy uzyskanych poprzez ablację komórek ES za pomocą CRISPR/Cas9 lub poprzez mikroiniekcję składników CRISPR/Cas9 do zapłodnionych komórek jajowych. Na przykład, wprowadzanie zmian często zachodzi w loci biallelicznych i nie jest specyficzne dla genu. Niedawno doniesiono, że komórki ES wykorzystujące technologię CRISPR/Cas9 mogą jednocześnie wprowadzać mutacje bialleliczne do nawet 5 genów (Nishizono i in., 2021). W tym celu mRNA Cas9 i pięć specyficznych dla genu gRNA zostały jednocześnie transfekowane do komórek ES. Podkreśla to obietnicę i skuteczność tej procedury, chociaż mutacje te mogły zostać przekazane, gdy linie założycielskie były hodowane w celu uzyskania myszy z pięciokrotnym knockoutem. Badanie donosi również o zaskakującym odkryciu: komórki ES nie są już potrzebne do tworzenia genetycznie modyfikowanych myszy. Zamiast tego, w celu usunięcia specyficznych produktów genów, mRNA i gRNA Cas9 wstrzykiwano do zarodków w stadium pojedynczej komórki. W rezultacie stworzono linie założycielskie knockout, które teoretycznie mogą być wykorzystane do badania konsekwencji delecji genów u myszy (Qin i in., 2016). Zatem CRISPR/Cas9 umożliwia tworzenie transgenicznych myszy do leczenia TNBC przy niższych kosztach niż tradycyjna inżynieria genetyczna. Wykorzystując system CRISPR/Cas, opracowano nowy model myszy knockout, który może skutecznie wprowadzać mutacje punktowe w jednym lub większej liczbie endogennych genów w TNBC. W oparciu o tę koncepcję można również opracować modele zwierzęce TNBC, wykorzystując usuwanie BRCA1 i p53 za pomocą CRISPR/Cas9, co skutkuje utratą naprawy HR, niestabilnością genomową i fenotypami mutacji (Annunziato i in., 2020).
Obecnie do diagnozowania TNBC stosuje się różne metody, takie jak mammografia, obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i ultrasonografia. Metody te mają jednak pewne ograniczenia. Mammografia służy do diagnozowania lokalnej tkanki piersi, a nie przerzutów, w których komórki nowotworowe migrują do innych narządów. Ultrasonografia nie jest wiarygodną metodą diagnozowania TNBC (Chen i Lee-Felker, 2023). MRI ma wyższą czułość niż ultrasonografia i mammografia, ale jego dokładność diagnostyczna jest ograniczona (Sha i Chen, 2022). Biopsja tkanki jest inwazyjnym sposobem identyfikacji komórek nowotworowych. Jednak w niektórych przypadkach biopsja może nie wykryć tkanki nowotworowej, jeśli igła zboczy z obszaru zainteresowania. Ponadto jest bardzo kosztowna i może być traumatyczna dla pacjenta. TNBC jest heterogennym rodzajem raka, więc biopsja może nie dostarczyć wystarczających informacji na temat rodzaju nowotworu. Dlatego pilnie potrzebna jest nowa, wiarygodna diagnostycznie metoda wykrywania TNBC. CRISPR/Cas9 może służyć jako wysoce czuła i mało inwazyjna alternatywa dla diagnostyki raka piersi. W tym celu strategie oparte na CRISPR/Cas9 mogą być wykorzystane do ulepszenia metod PCR w diagnostyce TNBC. Najpierw białka Cas9 i cpf1 systemu CRISPR są używane do usunięcia niespecyficznego DNA, a następnie te dwa białka (Cas9 i cpf1) mogą rozpoznać sekwencję PAM przed związaniem się z docelowym DNA (Deepak Singh i in., 2021). . Zatem PCR może identyfikować mutacje związane z rozwojem raka. W kilku badaniach przyjęto tę opartą na CRISPR strategię w celu wykrywania różnych mutacji w różnych nowotworach (Safari i in., 2019). Zatem metody PCR oparte na CRISPR mogą zmniejszyć zależność diagnostyki TNBC od metod inwazyjnych, takich jak immunohistochemia oparta na biopsji.
Zmiany genotypowe w regulacji receptorów hormonalnych wykazano również w TNBC (Chen i Russo, 2009). Strategie PCR oparte na CRISPR/Cas9, wykorzystujące mikromacierze do diagnostyki przyłóżkowej, mogą skutecznie monitorować te mutacje (Hajian i in., 2019). Mogą one również dostarczyć pracownikom służby zdrowia istotnych informacji na temat konkretnych mutacji u pacjentów z TNBC, co może pomóc w ulepszeniu ich przebiegu leczenia. Jednak ta łączona technika ma swoje ograniczenia. Dlatego konieczne są szeroko zakrojone badania, zanim metoda CRISPR/Cas-PCR będzie mogła być stosowana w opiece zdrowotnej w diagnostyce TNBC (Yang i in., 2019).