Diagnostyka różnicowa guzków płucnych zidentyfikowanych za pomocą tomografii komputerowej (TK) pozostaje wyzwaniem w praktyce klinicznej. W niniejszym artykule scharakteryzowano globalny metabolom 480 próbek surowicy, obejmujących osoby zdrowe, łagodne guzki płucne oraz gruczolakoraka płuc w stadium I. Gruczolakoraki wykazują unikalne profile metabolomiczne, podczas gdy guzki łagodne i osoby zdrowe charakteryzują się dużym podobieństwem w profilach metabolomicznych. W grupie odkrywczej (n = 306) zidentyfikowano zestaw 27 metabolitów, umożliwiający różnicowanie guzków łagodnych od złośliwych. Wartość AUC modelu dyskryminacyjnego w grupie walidacji wewnętrznej (n = 104) i walidacji zewnętrznej (n = 111) wynosiła odpowiednio 0,915 i 0,945. Analiza szlaku metabolicznego ujawniła zwiększone stężenie metabolitów glikolitycznych związane ze zmniejszonym stężeniem tryptofanu w surowicy gruczolakoraka płuc w porównaniu z guzkami łagodnymi i grupą kontrolną osób zdrowych, sugerując, że wychwyt tryptofanu promuje glikolizę w komórkach raka płuc. Nasze badanie podkreśla wartość biomarkerów metabolitów w surowicy w ocenie ryzyka wystąpienia guzków płucnych wykrytych za pomocą tomografii komputerowej.
Wczesna diagnoza ma kluczowe znaczenie dla poprawy wskaźników przeżycia u pacjentów onkologicznych. Wyniki amerykańskiego badania US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) i europejskiego badania NELSON Study wykazały, że badania przesiewowe z wykorzystaniem niskodawkowej tomografii komputerowej (LDCT) mogą znacząco zmniejszyć śmiertelność z powodu raka płuc w grupach wysokiego ryzyka1,2,3. Od czasu powszechnego stosowania LDCT w badaniach przesiewowych raka płuc, częstość przypadkowych radiograficznych wykryć bezobjawowych guzków płucnych stale rośnie4. Guzki płucne definiuje się jako ogniskowe zacienienia o średnicy do 3 cm5. Napotykamy trudności w ocenie prawdopodobieństwa złośliwości i radzeniu sobie z dużą liczbą guzków płucnych wykrytych przypadkowo w LDCT. Ograniczenia TK mogą prowadzić do częstych badań kontrolnych i wyników fałszywie dodatnich, co prowadzi do niepotrzebnej interwencji i nadmiernego leczenia6. Dlatego istnieje potrzeba opracowania wiarygodnych i użytecznych biomarkerów, aby prawidłowo identyfikować raka płuc we wczesnych stadiach i różnicować większość łagodnych guzków przy początkowym wykryciu7.
Kompleksowa analiza molekularna krwi (surowicy, osocza, mononuklearnych komórek krwi obwodowej), w tym genomika, proteomika czy metylacja DNA8,9,10, doprowadziła do wzrostu zainteresowania odkryciem biomarkerów diagnostycznych raka płuc. Tymczasem metody metabolomiczne mierzą komórkowe produkty końcowe, na które wpływają działania endogenne i egzogenne, i dlatego są stosowane do przewidywania początku i przebiegu choroby. Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas (LC-MS) jest szeroko stosowaną metodą w badaniach metabolomicznych ze względu na jej wysoką czułość i szeroki zakres dynamiki, który może obejmować metabolity o różnych właściwościach fizykochemicznych11,12,13. Chociaż globalna analiza metabolomiczna osocza/surowicy była wykorzystywana do identyfikacji biomarkerów związanych z diagnostyką raka płuc14,15,16,17 i skutecznością leczenia18, klasyfikatory metabolitów surowicy do rozróżniania łagodnych i złośliwych guzków płucnych nadal wymagają dogłębnych badań. - masowe badania.
Gruczolakorak i rak płaskonabłonkowy to dwa główne podtypy niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). Różne badania przesiewowe TK wskazują, że gruczolakorak jest najczęstszym typem histologicznym raka płuca1,19,20,21. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy ultrasprawną chromatografię cieczową ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) do przeprowadzenia analizy metabolomicznej na łącznie 695 próbkach surowicy, w tym zdrowych osobach kontrolnych, łagodnych guzkach płucnych oraz wykrytych w TK guzkach o średnicy ≤3 cm. Badanie przesiewowe w kierunku gruczolakoraka płuca w stadium I. Zidentyfikowaliśmy panel metabolitów w surowicy, który odróżnia gruczolakoraka płuca od łagodnych guzków i zdrowych osób kontrolnych. Analiza wzbogacenia szlaku metabolicznego wykazała, że nieprawidłowy metabolizm tryptofanu i glukozy to częste zaburzenia w gruczolakoraku płuca w porównaniu z łagodnymi guzkami i zdrowymi osobami kontrolnymi. Na koniec opracowaliśmy i zatwierdziliśmy klasyfikator metaboliczny surowicy o wysokiej swoistości i czułości, umożliwiający rozróżnianie złośliwych i łagodnych guzków płucnych wykrytych za pomocą LDCT, co może pomóc we wczesnej diagnostyce różnicowej i ocenie ryzyka.
W niniejszym badaniu retrospektywnie pobrano próbki surowicy dopasowane pod względem płci i wieku od 174 zdrowych osób z grupy kontrolnej, 292 pacjentów z łagodnymi guzkami płucnymi oraz 229 pacjentów z gruczolakorakiem płuc w stadium I. Charakterystykę demograficzną 695 pacjentów przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 1.
Jak pokazano na rysunku 1a, w Centrum Onkologicznym Uniwersytetu Sun Yat-sena pobrano łącznie 480 próbek surowicy, w tym 174 próbki kontrolne od zdrowych osób (HC), 170 próbek guzków łagodnych (BN) i 136 próbek gruczolakoraka płuc w stadium I (LA). Kohorta odkrywcza do nieukierunkowanego profilowania metabolomicznego z wykorzystaniem ultrasprawnej chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS). Jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1, zidentyfikowano metabolity różnicowe między LA i HC, LA i BN w celu opracowania modelu klasyfikacji i dalszej analizy szlaków różnicowych. 104 próbki pobrane przez Centrum Onkologiczne Uniwersytetu Sun Yat-sena i 111 próbek pobranych przez dwa inne szpitale poddano odpowiednio walidacji wewnętrznej i zewnętrznej.
a Populacja badawcza w kohorcie odkrywczej, która przeszła globalną analizę metabolomiki surowicy przy użyciu chromatografii cieczowej o wysokiej wydajności i spektrometrii masowej o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS). b Analiza dyskryminacyjna metodą cząstkowych najmniejszych kwadratów (PLS-DA) całkowitego metabolomu 480 próbek surowicy z kohorty badawczej, w tym zdrowych osób kontrolnych (HC, n = 174), łagodnych guzków (BN, n = 170) i gruczolakoraka płuc w stadium I (Los Angeles, n = 136). +ESI, tryb dodatniej jonizacji elektrosprayem, -ESI, tryb ujemnej jonizacji elektrosprayem. c–e Metabolity o istotnie różnych liczebnościach w dwóch podanych grupach (dwustronny test rang Wilcoxona ze znakami, skorygowana wartość p dla współczynnika fałszywych odkryć, FDR <0,05) są pokazane na czerwono (zmiana krotności > 1,2) i niebiesko (zmiana krotności < 0,83). ) pokazano na grafice wulkanu. f Hierarchiczna mapa cieplna klastrowania pokazująca istotne różnice w liczbie opisanych metabolitów między LA i BN. Dane źródłowe są dostarczane w postaci plików źródłowych.
Całkowity metabolom surowicy 174 HC, 170 BN i 136 LA w grupie odkrywczej został przeanalizowany za pomocą analizy UPLC-HRMS. Najpierw pokazujemy, że próbki kontroli jakości (QC) skupiają się ściśle w centrum nienadzorowanego modelu analizy głównych składowych (PCA), co potwierdza stabilność wyników niniejszego badania (Rysunek uzupełniający 2).
Jak pokazano w analizie dyskryminacyjnej metodą najmniejszych kwadratów cząstkowych (PLS-DA) na rysunku 1b, stwierdziliśmy wyraźne różnice między LA i BN, LA i HC w dodatnich (+ESI) i ujemnych (−ESI) trybach jonizacji elektrorozpyłowej. Nie stwierdzono jednak istotnych różnic między BN i HC w warunkach +ESI i -ESI.
Znaleźliśmy 382 cechy różnicowe między LA i HC, 231 cech różnicowych między LA i BN i 95 cech różnicowych między BN i HC (test rang znakowych Wilcoxona, FDR <0,05 i wielokrotna zmiana >1,2 lub <0,83) (Rysunek .1c-e). . Szczyty zostały dodatkowo adnotowane (Dane uzupełniające 3) względem bazy danych (biblioteka mzCloud/HMDB/Chemspider) według wartości m/z, czasu retencji i widma masowego fragmentacji (szczegóły opisane w sekcji Metody) 22 . Na koniec zidentyfikowano 33 i 38 adnotowanych metabolitów o istotnych różnicach w obfitości odpowiednio dla LA w porównaniu z BN (Rysunek 1f i Tabela uzupełniająca 2) i LA w porównaniu z HC (Rysunek uzupełniający 3 i Tabela uzupełniająca 2). Natomiast w BN i HC zidentyfikowano tylko 3 metabolity o istotnych różnicach w obfitości (Tabela uzupełniająca 2), co jest zgodne z nakładaniem się BN i HC w PLS-DA. Te zróżnicowane metabolity obejmują szeroki zakres substancji biochemicznych (Rysunek uzupełniający 4). Podsumowując, wyniki te wykazują istotne zmiany w metabolomie surowicy, które odzwierciedlają złośliwą transformację wczesnego stadium raka płuca w porównaniu z łagodnymi guzkami płuca lub osobami zdrowymi. Tymczasem podobieństwo metabolomu surowicy BN i HC sugeruje, że łagodne guzki płuca mogą mieć wiele wspólnych cech biologicznych ze zdrowymi osobami. Biorąc pod uwagę, że mutacje genu receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) są częste w podtypie 23 gruczolakoraka płuc, staraliśmy się określić wpływ mutacji napędowych na metabolom surowicy. Następnie przeanalizowaliśmy ogólny profil metabolomiczny 72 przypadków ze statusem EGFR w grupie gruczolakoraka płuca. Co ciekawe, w analizie PCA zaobserwowaliśmy porównywalne profile między pacjentami z mutacją EGFR (n = 41) a pacjentami z dzikim typem EGFR (n = 31) (Rysunek uzupełniający 5a). Zidentyfikowaliśmy jednak 7 metabolitów, których ilość była istotnie zmieniona u pacjentów z mutacją EGFR w porównaniu z pacjentami z dzikim typem EGFR (test t, p < 0,05 i zmiana krotności > 1,2 lub < 0,83) (Rysunek uzupełniający 5b). Większość tych metabolitów (5 z 7) to acylokarnityny, które odgrywają ważną rolę w szlakach utleniania kwasów tłuszczowych.
Jak zilustrowano w przepływie pracy przedstawionym na Rysunku 2a, biomarkery do klasyfikacji guzków uzyskano przy użyciu operatorów najmniejszego bezwzględnego skurczu i selekcji opartej na 33 różnicowych metabolitach zidentyfikowanych w LA (n = 136) i BN (n = 170). Najlepsza kombinacja zmiennych (LASSO) – model binarnej regresji logistycznej. Dziesięciokrotna walidacja krzyżowa została użyta do przetestowania niezawodności modelu. Wybór zmiennych i regularyzacja parametrów są korygowane przez karę za maksymalizację wiarygodności z parametrem λ24. Globalna analiza metabolomiczna została dodatkowo przeprowadzona niezależnie w grupie walidacji wewnętrznej (n = 104) i walidacji zewnętrznej (n = 111) w celu przetestowania wydajności klasyfikacji modelu dyskryminacyjnego. W rezultacie 27 metabolitów w zestawie odkrywczym zostało zidentyfikowanych jako najlepszy model dyskryminacyjny z największą średnią wartością AUC (rys. 2b), spośród których 9 miało zwiększoną aktywność, a 18 zmniejszoną aktywność w LA w porównaniu z BN (rys. 2c).
Przepływ pracy do zbudowania klasyfikatora guzków płucnych, w tym wybór najlepszego panelu metabolitów surowicy w zestawie odkrywczym przy użyciu binarnego modelu regresji logistycznej poprzez dziesięciokrotną walidację krzyżową i ocenę wydajności predykcyjnej w wewnętrznych i zewnętrznych zestawach walidacyjnych. b Statystyki walidacji krzyżowej modelu regresji LASSO do wyboru biomarkerów metabolicznych. Podane powyżej liczby reprezentują średnią liczbę biomarkerów wybranych przy danym λ. Czerwona linia przerywana reprezentuje średnią wartość AUC przy odpowiadającej wartości lambda. Szare słupki błędów reprezentują minimalne i maksymalne wartości AUC. Linia przerywana wskazuje najlepszy model z 27 wybranymi biomarkerami. AUC, obszar pod krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). c Zmiany krotności 27 wybranych metabolitów w grupie LA w porównaniu z grupą BN w grupie odkrywczej. Czerwona kolumna – aktywacja. Niebieska kolumna to spadek. Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) d–f, pokazujące moc modelu dyskryminacyjnego opartego na 27 kombinacjach metabolitów w zestawach odkrywczych, wewnętrznych i zewnętrznych. Dane źródłowe są dostarczane w postaci plików danych źródłowych.
Model predykcyjny został stworzony na podstawie ważonych współczynników regresji tych 27 metabolitów (Tabela uzupełniająca 3). Analiza ROC oparta na tych 27 metabolitach dała wartość pola pod krzywą (AUC) równą 0,933, czułość grupy odkrywczej wyniosła 0,868, a swoistość 0,859 (Rys. 2d). Tymczasem spośród 38 opisanych metabolitów różnicowych między LA i HC, zestaw 16 metabolitów osiągnął AUC równą 0,902, czułość równą 0,801 i swoistość równą 0,856 w odróżnianiu LA od HC (Rysunek uzupełniający 6a-c). Porównano również wartości AUC oparte na różnych progach zmiany krotności dla metabolitów różnicowych. Stwierdziliśmy, że model klasyfikacji działał najlepiej w odróżnianiu LA od BN (HC), gdy poziom zmiany krotności został ustawiony na 1,2 w porównaniu z 1,5 lub 2,0 (Rysunek uzupełniający 7a,b). Model klasyfikacji, oparty na 27 grupach metabolitów, został dodatkowo zweryfikowany w kohortach wewnętrznych i zewnętrznych. Wartość AUC wyniosła 0,915 (czułość 0,867, swoistość 0,811) w przypadku walidacji wewnętrznej i 0,945 (czułość 0,810, swoistość 0,979) w przypadku walidacji zewnętrznej (ryc. 2e, f). Aby ocenić skuteczność międzylaboratoryjną, 40 próbek z kohorty zewnętrznej przeanalizowano w laboratorium zewnętrznym, zgodnie z opisem w sekcji Metody. Dokładność klasyfikacji osiągnęła wartość AUC równą 0,925 (Rysunek uzupełniający 8). Ponieważ rak płaskonabłonkowy płuc (LUSC) jest drugim najczęściej występującym podtypem niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC) po gruczolakoraku płuc (LUAD), przetestowaliśmy również zweryfikowaną potencjalną użyteczność profili metabolicznych. BN i 16 przypadków LUSC. AUC rozróżniania pomiędzy LUSC i BN wynosiło 0,776 (Rysunek uzupełniający 9), co wskazuje na gorszą zdolność w porównaniu z rozróżnianiem pomiędzy LUAD i BN.
Badania wykazały, że rozmiar guzków na obrazach TK jest dodatnio skorelowany z prawdopodobieństwem złośliwości i pozostaje głównym wyznacznikiem leczenia guzków25,26,27. Analiza danych z dużej kohorty badania przesiewowego NELSON wykazała, że ryzyko złośliwości u osób z węzłami chłonnymi <5 mm było nawet podobne do ryzyka u osób bez węzłów chłonnych28. Dlatego minimalny rozmiar wymagający regularnego monitorowania TK wynosi 5 mm, zgodnie z zaleceniami Brytyjskiego Towarzystwa Klatki Piersiowej (BTS) i 6 mm, zgodnie z zaleceniami Towarzystwa Fleischnera29. Jednak guzki większe niż 6 mm i bez oczywistych łagodnych cech, zwane nieokreślonymi guzkami płucnymi (IPN), pozostają poważnym wyzwaniem w ocenie i leczeniu w praktyce klinicznej30,31. Następnie zbadaliśmy, czy rozmiar guzka wpływa na sygnatury metabolomiczne, wykorzystując połączone próbki z kohort odkrywczych i walidacyjnych. Koncentrując się na 27 zweryfikowanych biomarkerach, najpierw porównaliśmy profile PCA metabolomów HC i BN poniżej 6 mm. Stwierdziliśmy, że większość punktów danych dla HC i BN pokrywała się, co dowodzi, że poziomy metabolitów w surowicy były podobne w obu grupach (ryc. 3a). Mapy cech w różnych zakresach wielkości pozostały zachowane w BN i LA (ryc. 3b, c), natomiast zaobserwowano rozróżnienie między guzkami złośliwymi i łagodnymi w zakresie 6–20 mm (ryc. 3d). W tej kohorcie AUC wynosiło 0,927, swoistość 0,868, a czułość 0,820 w przewidywaniu złośliwości guzków o średnicy od 6 do 20 mm (ryc. 3e, f). Nasze wyniki pokazują, że klasyfikator może uchwycić zmiany metaboliczne spowodowane wczesną transformacją złośliwą, niezależnie od rozmiaru guzka.
ad Porównanie profili PCA między określonymi grupami na podstawie klasyfikatora metabolicznego 27 metabolitów. CC i BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. w LA 6–20 mm vs LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm i LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Krzywa charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) pokazująca wydajność modelu dyskryminacyjnego dla guzków 6–20 mm. f Wartości prawdopodobieństwa obliczono na podstawie modelu regresji logistycznej dla guzków o średnicy 6–20 mm. Szara linia przerywana przedstawia optymalną wartość odcięcia (0,455). Powyższe liczby przedstawiają odsetek przypadków prognozowanych dla Los Angeles. Użyj dwustronnego testu t-Studenta. PCA, analiza głównych składowych. Pole pod krzywą AUC. Dane źródłowe są dostarczane w postaci plików danych źródłowych.
Cztery próbki (w wieku 44–61 lat) o podobnych rozmiarach guzków płucnych (7–9 mm) zostały dodatkowo wybrane w celu zilustrowania skuteczności proponowanego modelu przewidywania złośliwości (ryc. 4a, b). Podczas wstępnego przesiewu Przypadek 1 przedstawił się jako guzek lity ze zwapnieniem, cechą związaną z łagodnością, podczas gdy Przypadek 2 przedstawił się jako nieokreślony, częściowo lity guzek bez oczywistych cech łagodnych. Trzy rundy kontrolnych tomografii komputerowej wykazały, że przypadki te pozostały stabilne przez okres 4 lat i dlatego zostały uznane za guzki łagodne (ryc. 4a). W porównaniu z oceną kliniczną seryjnych tomografii komputerowych, analiza metabolitów w surowicy w pojedynczym ujęciu z obecnym modelem klasyfikatora szybko i prawidłowo zidentyfikowała te łagodne guzki w oparciu o ograniczenia probabilistyczne (tabela 1). Rycina 4b w przypadku 3 przedstawia guzek z objawami retrakcji opłucnej, co jest najczęściej związane ze złośliwością32. Przypadek 4 przedstawiał nieokreślony, częściowo lity guzek bez dowodów na łagodną przyczynę. Wszystkie te przypadki zostały przewidziane jako złośliwe zgodnie z modelem klasyfikatora (Tabela 1). Ocenę gruczolakoraka płuc potwierdzono badaniem histopatologicznym po resekcji płuca (ryc. 4b). W przypadku zewnętrznego zestawu walidacyjnego, klasyfikator metaboliczny trafnie przewidział dwa przypadki nieokreślonych guzków płuc większych niż 6 mm (Rysunek uzupełniający 10).
Obrazy TK okna osiowego płuc w dwóch przypadkach łagodnych guzków. W przypadku 1, tomografia komputerowa wykonana po 4 latach wykazała stabilny, lity guzek o średnicy 7 mm ze zwapnieniem w prawym dolnym płacie. W przypadku 2, tomografia komputerowa wykonana po 5 latach wykazała stabilny, częściowo lity guzek o średnicy 7 mm w prawym górnym płacie. b Obrazy TK okna osiowego płuc i odpowiadające im badania patologiczne w dwóch przypadkach gruczolakoraka w stadium I przed resekcją płuca. Przypadek 3 wykazał guzek o średnicy 8 mm w prawym górnym płacie z cofnięciem opłucnej. Przypadek 4 wykazał częściowo lity guzek typu matowego szkła o średnicy 9 mm w lewym górnym płacie. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) wyciętej tkanki płucnej (pasek skali = 50 μm) wykazujące zrazikowy wzór wzrostu gruczolakoraka płuc. Strzałki wskazują guzki wykryte na obrazach TK. Obrazy H&E to obrazy reprezentatywne wielu (>3) pól mikroskopowych badanych przez patologa.
Łącznie nasze wyniki wskazują na potencjalną wartość biomarkerów metabolitów w surowicy w diagnostyce różnicowej guzków płucnych, co może stanowić wyzwanie przy ocenie wyników tomografii komputerowej.
W oparciu o zweryfikowany panel różnicowych metabolitów, staraliśmy się zidentyfikować biologiczne korelaty głównych zmian metabolicznych. Analiza wzbogacenia szlaków metabolicznych KEGG przeprowadzona przez MetaboAnalyst zidentyfikowała 6 wspólnych, istotnie zmienionych szlaków w obu grupach (LA vs. HC i LA vs. BN, skorygowane p ≤ 0,001, efekt > 0,01). Zmiany te charakteryzowały się zaburzeniami metabolizmu pirogronianu, tryptofanu, niacyny i nikotynamidu, glikolizy, cyklu TCA oraz metabolizmu puryn (ryc. 5a). Następnie przeprowadziliśmy ukierunkowaną metabolomikę w celu weryfikacji głównych zmian za pomocą kwantyfikacji bezwzględnej. Oznaczenie wspólnych metabolitów w często zmienionych szlakach metabolicznych za pomocą spektrometrii mas z potrójnym kwadrupolem (QQQ) z wykorzystaniem autentycznych wzorców metabolitów. Charakterystykę demograficzną grupy docelowej badania metabolomicznego przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 4. Zgodnie z naszymi wynikami globalnej metabolomiki, analiza ilościowa potwierdziła, że stężenie hipoksantyny i ksantyny, pirogronianu i mleczanu było podwyższone w LA w porównaniu z BN i HC (ryc. 5b, c, p <0,05). Nie stwierdzono jednak istotnych różnic w stężeniach tych metabolitów między BN i HC.
Analiza wzbogacenia szlaku KEGG istotnie różnych metabolitów w grupie LA w porównaniu z grupami BN i HC. Zastosowano dwustronny test Globaltest, a wartości p skorygowano metodą Holma-Bonferroniego (skorygowane p ≤ 0,001 i wielkość efektu > 0,01). b–d Wykresy skrzypcowe przedstawiające poziomy hipoksantyny, ksantyny, mleczanu, pirogronianu i tryptofanu w surowicy HC, BN i LA określone metodą LC-MS/MS (n = 70 na grupę). Białe i czarne linie przerywane oznaczają odpowiednio medianę i kwartyl. e Wykres skrzypcowy przedstawiający znormalizowaną ekspresję mRNA Log2TPM (transkryptów na milion) SLC7A5 i QPRT w gruczolakoraku płuc (n = 513) w porównaniu z prawidłową tkanką płuc (n = 59) w zestawie danych LUAD-TCGA. Białe pole przedstawia zakres międzykwartylowy, pozioma czarna linia w środku przedstawia medianę, a pionowa czarna linia wychodząca z pola przedstawia 95% przedział ufności (CI). f Wykres korelacji Pearsona ekspresji SLC7A5 i GAPDH w gruczolakoraku płuc (n = 513) i prawidłowej tkance płuc (n = 59) w zestawie danych TCGA. Szary obszar przedstawia 95% CI. r, współczynnik korelacji Pearsona. g Znormalizowane poziomy tryptofanu komórkowego w komórkach A549 transfekowanych niespecyficzną kontrolą shRNA (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) określone metodą LC-MS/MS. Przedstawiono analizę statystyczną pięciu biologicznie niezależnych próbek w każdej grupie. h Poziomy komórkowe NADt (całkowity NAD, w tym NAD+ i NADH) w komórkach A549 (NC) i komórkach A549 z wyciszonym genem SLC7A5 (Sh1, Sh2). Przedstawiono analizę statystyczną trzech biologicznie niezależnych próbek w każdej grupie. Aktywność glikolityczną komórek A549 przed i po obniżeniu ekspresji SLC7A5 mierzono metodą zakwaszania pozakomórkowego (ECAR) (n = 4 biologicznie niezależne próbki w każdej grupie). 2-DG,2-deoksy-D-glukoza. W (b–h) zastosowano dwustronny test t-Studenta. W (g–i) słupki błędów przedstawiają średnią ± SD, każde doświadczenie przeprowadzono trzykrotnie niezależnie, a wyniki były podobne. Dane źródłowe przedstawiono w postaci plików danych źródłowych.
Biorąc pod uwagę istotny wpływ zmienionego metabolizmu tryptofanu w grupie LA, oceniliśmy również poziom tryptofanu w surowicy w grupach HC, BN i LA przy użyciu QQQ. Stwierdziliśmy, że poziom tryptofanu w surowicy był niższy w grupie LA w porównaniu z grupą HC lub BN (p < 0,001, rycina 5d), co jest zgodne z wcześniejszymi wynikami, że poziomy tryptofanu we krwi są niższe u pacjentów z rakiem płuc niż u zdrowych osób z grupy kontrolnej33,34,35. W innym badaniu z użyciem znacznika PET/CT 11C-metylo-L-tryptofanu stwierdzono, że czas retencji sygnału tryptofanu w tkance raka płuc był istotnie dłuższy w porównaniu ze zmianami łagodnymi lub tkanką zdrową36. Stawiamy hipotezę, że spadek poziomu tryptofanu w surowicy LA może odzwierciedlać aktywny wychwyt tryptofanu przez komórki raka płuc.
Wiadomo również, że końcowym produktem szlaku kinureninowego katabolizmu tryptofanu jest NAD+37,38, który jest ważnym substratem dla reakcji gliceraldehydu-3-fosforanu z 1,3-bisfosfoglicerynianem w glikolizie39. Podczas gdy wcześniejsze badania koncentrowały się na roli katabolizmu tryptofanu w regulacji odporności, my staraliśmy się wyjaśnić wzajemne oddziaływanie między dysregulacją tryptofanu a szlakami glikolizy obserwowanymi w niniejszym badaniu. Wiadomo, że członek 5 rodziny transporterów substancji rozpuszczonych 7 (SLC7A5) jest transporterem tryptofanu43,44,45. Fosforybozylotransferaza kwasu chinolinowego (QPRT) to enzym zlokalizowany poniżej szlaku kinureninowego, który przekształca kwas chinolinowy w NAMN46. Analiza zbioru danych LUAD TCGA wykazała, że zarówno SLC7A5, jak i QPRT były istotnie podwyższone w tkance guza w porównaniu z tkanką zdrową (ryc. 5e). Wzrost ten zaobserwowano w stadiach I i II, a także III i IV gruczolakoraka płuc (Rysunek uzupełniający 11), co wskazuje na wczesne zaburzenia metabolizmu tryptofanu związane z nowotworzeniem.
Ponadto zestaw danych LUAD-TCGA wykazał dodatnią korelację między ekspresją mRNA SLC7A5 i GAPDH w próbkach pacjentów onkologicznych (r = 0,45, p = 1,55E-26, Rysunek 5f). Natomiast nie stwierdzono istotnej korelacji między takimi sygnaturami genów w prawidłowej tkance płucnej (r = 0,25, p = 0,06, Rysunek 5f). Wyciszenie ekspresji SLC7A5 (Rysunek uzupełniający 12) w komórkach A549 znacząco zmniejszyło poziom tryptofanu i NAD(H) w komórkach (Rysunek 5g,h), co skutkowało osłabieniem aktywności glikolitycznej mierzonej za pomocą wskaźnika zakwaszenia pozakomórkowego (ECAR) (Rysunek 1). 5i). Zatem, w oparciu o zmiany metaboliczne w surowicy i detekcję in vitro, stawiamy hipotezę, że metabolizm tryptofanu może wytwarzać NAD+ poprzez szlak kinureninowy i odgrywać ważną rolę w promowaniu glikolizy w raku płuc.
Badania wykazały, że duża liczba nieokreślonych guzków płucnych wykrytych za pomocą LDCT może skutkować koniecznością dodatkowych badań, takich jak PET-CT, biopsja płuc i nadmiernego leczenia z powodu fałszywie dodatniej diagnozy nowotworu złośliwego.31 Jak pokazano na rycinie 6, nasze badanie zidentyfikowało panel metabolitów w surowicy o potencjalnej wartości diagnostycznej, które mogą poprawić stratyfikację ryzyka i późniejsze leczenie guzków płucnych wykrytych za pomocą TK.
Guzki płucne ocenia się za pomocą niskodawkowej tomografii komputerowej (LDCT) z cechami obrazowymi sugerującymi łagodne lub złośliwe przyczyny. Niepewny wynik leczenia guzków może prowadzić do częstych wizyt kontrolnych, niepotrzebnych interwencji i nadmiernego leczenia. Włączenie klasyfikatorów metabolicznych w surowicy o wartości diagnostycznej może usprawnić ocenę ryzyka i późniejsze leczenie guzków płucnych. Pozytonowa tomografia emisyjna PET.
Dane z amerykańskiego badania NLST i europejskiego badania NELSON sugerują, że badania przesiewowe grup wysokiego ryzyka z wykorzystaniem niskodawkowej tomografii komputerowej (LDCT) mogą zmniejszyć śmiertelność z powodu raka płuca1,3. Jednak ocena ryzyka i późniejsze postępowanie kliniczne w przypadku dużej liczby przypadkowo wykrytych guzków płucnych za pomocą LDCT pozostają największym wyzwaniem. Głównym celem jest optymalizacja prawidłowej klasyfikacji istniejących protokołów opartych na LDCT poprzez uwzględnienie wiarygodnych biomarkerów.
Niektóre biomarkery molekularne, takie jak metabolity we krwi, zidentyfikowano poprzez porównanie raka płuca ze zdrowymi osobami kontrolnymi15,17. W niniejszym badaniu skupiliśmy się na zastosowaniu analizy metabolomicznej surowicy w celu rozróżnienia łagodnych i złośliwych guzków płuc przypadkowo wykrytych za pomocą LDCT. Porównaliśmy globalny metabolom surowicy próbek zdrowej grupy kontrolnej (HC), łagodnych guzków płuca (BN) oraz gruczolakoraka płuca w stadium I (LA) za pomocą analizy UPLC-HRMS. Stwierdziliśmy, że HC i BN miały podobne profile metaboliczne, podczas gdy LA wykazywał istotne różnice w porównaniu z HC i BN. Zidentyfikowaliśmy dwa zestawy metabolitów surowicy, które różnicują LA od HC i BN.
Obecny schemat identyfikacji guzków łagodnych i złośliwych oparty na LDCT opiera się głównie na rozmiarze, gęstości, morfologii i tempie wzrostu guzków w czasie30. Poprzednie badania wykazały, że rozmiar guzków jest ściśle związany z prawdopodobieństwem raka płuc. Nawet u pacjentów wysokiego ryzyka ryzyko złośliwości w węzłach chłonnych <6 mm wynosi <1%. Ryzyko złośliwości w przypadku guzków o wymiarach od 6 do 20 mm waha się od 8% do 64%30. Dlatego też Towarzystwo Fleischnera zaleca średnicę odcięcia 6 mm dla rutynowej kontroli za pomocą TK.29 Jednak ocena ryzyka i leczenie nieokreślonych guzków płucnych (IPN) większych niż 6 mm nie zostały odpowiednio przeprowadzone31. Obecne leczenie wrodzonych wad serca opiera się zwykle na czujnej obserwacji z częstym monitorowaniem za pomocą TK.
Na podstawie zwalidowanego metabolomu, po raz pierwszy wykazaliśmy nakładanie się sygnatur metabolomicznych u osób zdrowych i guzków łagodnych <6 mm. Podobieństwo biologiczne jest zgodne z wcześniejszymi wynikami TK, zgodnie z którymi ryzyko złośliwości guzków <6 mm jest tak niskie, jak u osób bez węzłów chłonnych.30 Należy zauważyć, że nasze wyniki wykazują również, że guzki łagodne <6 mm i ≥6 mm mają wysokie podobieństwo w profilach metabolomicznych, co sugeruje, że funkcjonalna definicja łagodnej etiologii jest spójna niezależnie od rozmiaru guzka. Zatem nowoczesne diagnostyczne panele metabolitów w surowicy mogą stanowić pojedynczy test wykluczający, gdy guzki zostaną początkowo wykryte w TK i potencjalnie zmniejszyć konieczność seryjnego monitorowania. Jednocześnie ten sam panel biomarkerów metabolicznych odróżnia guzki złośliwe o rozmiarze ≥6 mm od guzków łagodnych i dostarcza dokładnych przewidywań dla IPN o podobnej wielkości i niejednoznacznych cechach morfologicznych na obrazach TK. Ten klasyfikator metabolizmu surowicy sprawdził się w przewidywaniu złośliwości guzków ≥6 mm z AUC 0,927. Podsumowując, nasze wyniki wskazują, że unikalne sygnatury metabolomiczne surowicy mogą specyficznie odzwierciedlać wczesne zmiany metaboliczne wywołane przez guz i mieć potencjalną wartość jako predyktory ryzyka, niezależnie od rozmiaru guzka.
Warto zauważyć, że gruczolakorak płuc (LUAD) i rak płaskonabłonkowy (LUSC) to główne typy niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). Biorąc pod uwagę, że LUSC jest silnie związany z paleniem tytoniu47, a LUAD jest najczęstszą histologią przypadkowo wykrytych guzków płuc w badaniu przesiewowym TK48, nasz model klasyfikacyjny został opracowany specjalnie dla próbek gruczolakoraka w stadium I. Wang i współpracownicy również skupili się na LUAD i zidentyfikowali dziewięć sygnatur lipidowych za pomocą lipidomiki, aby odróżnić raka płuc we wczesnym stadium od osób zdrowych17. Przetestowaliśmy obecny model klasyfikacyjny na 16 przypadkach LUSC w stadium I i 74 łagodnych guzkach i zaobserwowaliśmy niską dokładność przewidywania LUSC (AUC 0,776), co sugeruje, że LUAD i LUSC mogą mieć własne sygnatury metabolomiczne. Wykazano, że LUAD i LUSC różnią się pod względem etiologii, pochodzenia biologicznego i aberracji genetycznych49. Dlatego też inne typy histologii powinny zostać uwzględnione w modelach szkoleniowych do wykrywania raka płuc na poziomie populacyjnym w ramach programów badań przesiewowych.
W niniejszym badaniu zidentyfikowaliśmy sześć najczęściej zmienianych szlaków metabolicznych w gruczolakoraku płuc w porównaniu ze zdrowymi osobami kontrolnymi i łagodnymi guzkami. Ksantyna i hipoksantyna są powszechnymi metabolitami szlaku metabolicznego puryn. Zgodnie z naszymi wynikami, stężenia metabolitów pośrednich związanych z metabolizmem puryn były istotnie podwyższone w surowicy lub tkankach pacjentów z gruczolakorakiem płuc w porównaniu ze zdrowymi osobami kontrolnymi lub pacjentami w stadium przedinwazyjnym15,50. Podwyższone poziomy ksantyny i hipoksantyny w surowicy mogą odzwierciedlać anabolizm wymagany przez szybko proliferujące komórki nowotworowe. Dysregulacja metabolizmu glukozy jest dobrze znaną cechą charakterystyczną metabolizmu nowotworów51. W niniejszym badaniu zaobserwowaliśmy istotny wzrost stężenia pirogronianu i mleczanu w grupie LA w porównaniu z grupą HC i BN, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami o nieprawidłowościach szlaków glikolizy w profilach metabolomu surowicy pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC) i zdrowych osób kontrolnych. Wyniki są spójne52,53.
Co ważne, zaobserwowaliśmy odwrotną korelację między metabolizmem pirogronianu i tryptofanu w surowicy gruczolakoraków płuc. Stężenia tryptofanu w surowicy były obniżone w grupie LA w porównaniu z grupą HC lub BN. Co ciekawe, wcześniejsze badanie na dużą skalę z wykorzystaniem prospektywnej kohorty wykazało, że niskie poziomy krążącego tryptofanu były związane ze zwiększonym ryzykiem raka płuc 54 . Tryptofan jest niezbędnym aminokwasem, który pozyskujemy wyłącznie z pożywienia. Wnioskujemy, że wyczerpanie tryptofanu w surowicy w gruczolakoraku płuc może odzwierciedlać szybkie wyczerpanie tego metabolitu. Powszechnie wiadomo, że końcowy produkt katabolizmu tryptofanu poprzez szlak kinureninowy jest źródłem syntezy de novo NAD+. Ponieważ NAD+ jest wytwarzany głównie poprzez szlak ratunkowy, znaczenie NAD+ w metabolizmie tryptofanu w zdrowiu i chorobie pozostaje do ustalenia46. Nasza analiza bazy danych TCGA wykazała, że ekspresja transportera tryptofanu 7A5 (SLC7A5) była istotnie zwiększona w gruczolakoraku płuc w porównaniu z grupą kontrolną i dodatnio korelowała z ekspresją enzymu glikolitycznego GAPDH. Wcześniejsze badania koncentrowały się głównie na roli katabolizmu tryptofanu w hamowaniu przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej40,41,42. W niniejszej pracy wykazujemy, że zahamowanie wychwytu tryptofanu poprzez obniżenie ekspresji SLC7A5 w komórkach raka płuc prowadzi do późniejszego spadku poziomu NAD w komórkach i jednoczesnego osłabienia aktywności glikolitycznej. Podsumowując, nasze badanie dostarcza biologicznych podstaw dla zmian w metabolizmie surowicy związanych ze złośliwą transformacją gruczolakoraka płuc.
Mutacje EGFR są najczęstszymi mutacjami napędowymi u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC). W naszym badaniu odkryliśmy, że pacjenci z mutacją EGFR (n = 41) mieli ogólne profile metabolomiczne podobne do pacjentów z dzikim typem EGFR (n = 31), chociaż zaobserwowaliśmy obniżone poziomy w surowicy u niektórych pacjentów z mutacją EGFR u pacjentów acylokarnitynowych. Ustaloną funkcją acylokarnityn jest transport grup acylowych z cytoplazmy do macierzy mitochondrialnej, co prowadzi do utleniania kwasów tłuszczowych w celu wytworzenia energii55. Zgodnie z naszymi odkryciami, niedawne badanie również zidentyfikowało podobne profile metabolomu między guzami z mutacją EGFR i z dzikim typem EGFR, analizując globalny metabolom 102 próbek tkanki gruczolakoraka płuc50. Co ciekawe, zawartość acylokarnityny została również stwierdzona w grupie z mutacją EGFR. Dlatego też, czy zmiany w poziomach acylokarnityny odzwierciedlają zmiany metaboliczne indukowane przez EGFR i leżące u ich podstaw szlaki molekularne, mogą wymagać dalszych badań.
Podsumowując, nasze badanie ustanawia klasyfikator metaboliczny surowicy do celów diagnostyki różnicowej guzków płucnych i proponuje schemat postępowania, który może zoptymalizować ocenę ryzyka i ułatwić postępowanie kliniczne w oparciu o badanie tomografii komputerowej.
Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Onkologicznego Uniwersytetu Sun Yat-sena, Pierwszego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Sun Yat-sena oraz Komisję Etyczną Szpitala Onkologicznego Uniwersytetu Zhengzhou. W grupach odkrywczej i walidacyjnej pobrano 174 surowice od zdrowych osób i 244 surowice od osób z guzkami łagodnymi, poddawanych corocznym badaniom lekarskim w Departamencie Kontroli i Prewencji Raka, Centrum Onkologiczne Uniwersytetu Sun Yat-sena, oraz 166 przypadków guzków łagodnych. Gruczolakoraki płuc w stadium I pobrano z Centrum Onkologicznego Uniwersytetu Sun Yat-sena. W kohorcie walidacyjnej zewnętrznej odnotowano 48 przypadków guzków łagodnych, 39 przypadków gruczolakoraka płuc w stadium I z Pierwszego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Sun Yat-sena oraz 24 przypadki gruczolakoraka płuc w stadium I ze Szpitala Onkologicznego Uniwersytetu Zhengzhou. Centrum Onkologiczne Uniwersytetu Sun Yat-sena zebrało również 16 przypadków płaskonabłonkowego raka płuca w stadium I, aby przetestować zdolność diagnostyczną ustalonego klasyfikatora metabolicznego (charakterystykę pacjentów przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 5). Próbki z kohorty odkrywczej i kohorty walidacyjnej wewnętrznej zebrano w okresie od stycznia 2018 r. do maja 2020 r. Próbki do kohorty walidacyjnej zewnętrznej zebrano w okresie od sierpnia 2021 r. do października 2022 r. Aby zminimalizować uprzedzenia ze względu na płeć, do każdej kohorty przypisano w przybliżeniu równą liczbę przypadków męskich i żeńskich. Zespół Odkrywczy i Zespół ds. Recenzji Wewnętrznej. Płeć uczestników została określona na podstawie samooceny. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników i nie przyznano żadnego wynagrodzenia. Pacjenci z łagodnymi guzkami to osoby ze stabilnym wynikiem tomografii komputerowej po 2 do 5 latach w momencie analizy, z wyjątkiem 1 przypadku z zewnętrznej próbki walidacyjnej, który został pobrany przedoperacyjnie i zdiagnozowany histopatologicznie. Z wyjątkiem przewlekłego zapalenia oskrzeli. Przypadki gruczolakoraka płuc pobrano przed resekcją płuca i potwierdzono rozpoznaniem histopatologicznym. Próbki krwi pobrano na czczo do probówek do separacji surowicy bez antykoagulantów. Próbki krwi krzepły przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano z przyspieszeniem 2851 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C w celu zebrania supernatantu surowicy. Porcje surowicy zamrożono w temperaturze -80°C do momentu ekstrakcji metabolitów. Wydział Profilaktyki Nowotworów i Badań Medycznych Centrum Onkologicznego Uniwersytetu Sun Yat-sena pobrał pulę surowicy od 100 zdrowych dawców, w tym taką samą liczbę mężczyzn i kobiet w wieku od 40 do 55 lat. Zmieszano równe objętości próbek od każdego dawcy, a powstałą pulę podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze -80°C. Mieszaninę surowicy wykorzystano jako materiał odniesienia do kontroli jakości i standaryzacji danych.
Surowicę referencyjną i próbki testowe rozmrożono, a metabolity ekstrahowano metodą ekstrakcji łączonej (MTBE/metanol/woda)56. W skrócie, 50 μl surowicy zmieszano z 225 μl lodowatego metanolu i 750 μl lodowatego eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE). Wymieszano mieszaninę i inkubowano na lodzie przez 1 godzinę. Następnie próbki zmieszano i wirowano ze 188 μl wody o czystości MS zawierającej wzorce wewnętrzne (mleczan 13C, pirogronian 13C3, metioninę 13C i izoleucynę 13C6, zakupione w Cambridge Isotope Laboratories). Następnie mieszaninę wirowano z prędkością 15 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a dolną fazę przeniesiono do dwóch probówek (po 125 μl każda) w celu przeprowadzenia analizy LC-MS w trybie dodatnim i ujemnym. Na koniec próbkę odparowano do sucha w wysokoobrotowym koncentratorze próżniowym.
Wysuszone metabolity rozpuszczono w 120 μl 80% acetonitrylu, wirowano przez 5 min i wirowano z prędkością 15 000 × g przez 10 min w temperaturze 4°C. Supernatanty przeniesiono do fiolek z bursztynowego szkła z mikrowkładkami do badań metabolomicznych. Nieukierunkowana analiza metabolomiczna została przeprowadzona na platformie ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS). Metabolity rozdzielono za pomocą systemu UPLC Dionex Ultimate 3000 z kolumną ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). W trybie jonów dodatnich fazy ruchome stanowiły 95% (A) i 50% acetonitrylu (B), każda zawierająca 10 mmol/l octanu amonu i 0,1% kwasu mrówkowego. W trybie negatywnym fazy ruchome A i B zawierały odpowiednio 95% i 50% acetonitrylu, obie fazy zawierały 10 mmol/l octanu amonu, pH = 9. Program gradientu był następujący: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. Kolumnę utrzymywano w temperaturze 40°C, a próbkę w temperaturze 10°C w autosamplerze. Szybkość przepływu wynosiła 0,3 ml/min, a objętość wtrysku wynosiła 3 μl. Spektrometr mas Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) ze źródłem jonizacji elektrospray (ESI) pracował w trybie pełnego skanowania i był sprzężony z trybem monitorowania ddMS2 w celu zebrania dużych ilości danych. Parametry MS ustawiono następująco: napięcie natrysku +3,8 kV/-3,2 kV, temperatura kapilary 320°C, gaz osłonowy 40 arb, gaz pomocniczy 10 arb, temperatura grzałki sondy 350°C, zakres skanowania 70–1050 m3/h, rozdzielczość 70 000. Dane pozyskano za pomocą oprogramowania Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Aby ocenić jakość danych, zbiorcze próbki kontroli jakości (QC) wygenerowano poprzez pobranie 10 μl alikwot supernatantu z każdej próbki. Sześć wstrzyknięć próbek kontroli jakości zostało przeanalizowanych na początku sekwencji analitycznej w celu oceny stabilności systemu UPLC-MS. Próbki kontroli jakości są następnie okresowo wprowadzane do partii. Wszystkie 11 partii próbek surowicy w tym badaniu zostało przeanalizowanych za pomocą LC-MS. Alikwoty mieszaniny zbiorczej surowicy od 100 zdrowych dawców zostały wykorzystane jako materiał odniesienia w poszczególnych partiach w celu monitorowania procesu ekstrakcji i dostosowania do efektów między partiami. Nieukierunkowana analiza metabolomiczna kohorty odkrywczej, kohorty walidacyjnej wewnętrznej i kohorty walidacyjnej zewnętrznej została przeprowadzona w Centrum Metabolomiki Uniwersytetu Sun Yat-sena. Zewnętrzne laboratorium Centrum Analizy i Testowania Uniwersytetu Technologicznego w Guangdong również przeanalizowało 40 próbek z kohorty zewnętrznej w celu przetestowania wydajności modelu klasyfikatora.
Po ekstrakcji i rekonstytucji, absolutną ilość metabolitów w surowicy zmierzono przy użyciu ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas tandemową (Agilent 6495 potrójny kwadrupol) ze źródłem jonizacji przez elektrorozpylanie (ESI) w trybie monitorowania wielu reakcji (MRM). Do rozdzielenia metabolitów użyto kolumny ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Faza ruchoma składała się z 90% (A) i 5% acetonitrylu (B) z 10 mmol/l octanu amonu i 0,1% roztworu amoniaku. Program gradientu był następujący: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0% B. Kolumnę utrzymywano w temperaturze 40°C, a próbkę w temperaturze 10°C w autosamplerze. Przepływ wynosił 0,3 ml/min, a objętość wtrysku 1 μl. Parametry MS ustawiono następująco: napięcie kapilary ±3,5 kV, ciśnienie nebulizatora 35 psi, przepływ gazu osłonowego 12 l/min, temperatura gazu osłonowego 350°C, temperatura gazu suszącego 250°C i przepływ gazu suszącego 14 l/min. Konwersje MRM tryptofanu, pirogronianu, mleczanu, hipoksantyny i ksantyny wynosiły odpowiednio 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 i 151,0–107,9. Dane zebrano za pomocą analizatora Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). W próbkach surowicy, tryptofan, pirogronian, mleczan, hipoksantynę i ksantynę oznaczono ilościowo za pomocą krzywych kalibracyjnych roztworów mieszanin wzorcowych. W próbkach komórek zawartość tryptofanu znormalizowano do wzorca wewnętrznego i masy białek komórkowych.
Ekstrakcję pików (m/z i czas retencji (RT)) przeprowadzono przy użyciu Compound Discovery 3.1 i TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Aby wyeliminować potencjalne różnice między partiami, każdy charakterystyczny pik próbki testowej podzielono przez charakterystyczny pik materiału odniesienia z tej samej partii, aby uzyskać względną obfitość. Względne odchylenia standardowe wewnętrznych standardów przed i po standaryzacji przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 6. Różnice między dwiema grupami charakteryzowano za pomocą wskaźnika fałszywych odkryć (FDR < 0,05, test rang znakowych Wilcoxona) i krotności zmiany (> 1,2 lub < 0,83). Surowe dane MS wyodrębnionych cech i dane referencyjne MS skorygowane o surowicę przedstawiono odpowiednio w Danych uzupełniających 1 i Danych uzupełniających 2. Adnotacje pików przeprowadzono na podstawie czterech zdefiniowanych poziomów identyfikacji, obejmujących zidentyfikowane metabolity, przypuszczalnie adnotowane związki, przypuszczalnie scharakteryzowane klasy związków i nieznane związki22. Na podstawie przeszukiwania baz danych w Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), związki biologiczne z dopasowanymi standardami MS/MS lub dokładnymi adnotacjami dopasowania w mzCloud (wynik > 85) lub Chemspider zostały ostatecznie wybrane jako związki pośrednie między metabolomami różnicowymi. Adnotacje pików dla każdej cechy znajdują się w Danych Uzupełniających 3. Do jednowymiarowej analizy sumarycznej znormalizowanej liczebności metabolitów wykorzystano program MetaboAnalyst 5.0. MetaboAnalyst 5.0 ocenił również analizę wzbogacenia szlaku KEGG w oparciu o istotnie różne metabolity. Analizę głównych składowych (PCA) i analizę dyskryminacyjną metodą cząstkowych najmniejszych kwadratów (PLS-DA) przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania ropls (wersja 1.26.4) z normalizacją stosu i autoskalowaniem. Optymalny model biomarkerów metabolitów do przewidywania złośliwości guzków został wygenerowany przy użyciu binarnej regresji logistycznej z najmniejszym bezwzględnym skurczem i operatorem selekcji (LASSO, pakiet R w wersji 4.1-3). Wydajność modelu dyskryminacyjnego w zestawach detekcji i walidacji została scharakteryzowana poprzez oszacowanie AUC na podstawie analizy ROC zgodnie z pakietem pROC (wersja 1.18.0). Optymalny próg prawdopodobieństwa uzyskano na podstawie maksymalnego wskaźnika Youdena modelu (czułość + swoistość – 1). Próbki z wartościami niższymi lub wyższymi od progu będą przewidywane odpowiednio jako guzki łagodne i gruczolakorak płuc.
Komórki A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) hodowano w pożywce F-12K zawierającej 10% FBS. Sekwencje krótkiego RNA o strukturze spinki do włosów (shRNA) ukierunkowane na SLC7A5 oraz kontrolę nieukierunkowaną (NC) wprowadzono do wektora lentiwirusowego pLKO.1-puro. Sekwencje antysensowne shSLC7A5 są następujące: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Przeciwciała przeciwko SLC7A5 (#5347) i tubulinie (#2148) zakupiono od Cell Signaling Technology. Przeciwciała przeciwko SLC7A5 i tubulinie użyto w rozcieńczeniu 1:1000 do analizy Western blot.
Test stresu glikolitycznego Seahorse XF mierzy poziom zakwaszenia pozakomórkowego (ECAR). W teście glukoza, oligomycyna A i 2-DG były podawane sekwencyjnie w celu sprawdzenia zdolności komórek do glikolizy, mierzonej za pomocą ECAR.
Komórki A549 transfekowane kontrolą niecelującą (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) umieszczono na noc w płytkach o średnicy 10 cm. Metabolity komórek wyekstrahowano 1 ml lodowatego 80% wodnego metanolu. Komórki w roztworze metanolu zeskrobano, zebrano do nowej probówki i wirowano z prędkością 15 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Zebrano 800 µl supernatantu i wysuszono za pomocą wysokoobrotowego koncentratora próżniowego. Wysuszone peletki metabolitów analizowano następnie pod kątem poziomu tryptofanu za pomocą LC-MS/MS, jak opisano powyżej. Poziomy NAD(H) w komórkach A549 (NC i shSLC7A5) mierzono za pomocą ilościowego zestawu kolorymetrycznego NAD+/NADH (#K337, BioVision) zgodnie z instrukcją producenta. W celu normalizacji ilości metabolitów mierzono poziom białka dla każdej próbki.
Nie zastosowano żadnych metod statystycznych do wstępnego określenia liczebności próby. Poprzednie badania metabolomiczne mające na celu odkrycie biomarkerów15,18 były uważane za punkty odniesienia dla określenia liczebności próby i w porównaniu z tymi raportami nasza próba była odpowiednia. Z badanej kohorty nie wykluczono żadnych próbek. Próbki surowicy zostały losowo przydzielone do grupy odkrywczej (306 przypadków, 74,6%) i wewnętrznej grupy walidacyjnej (104 przypadki, 25,4%) w przypadku nieukierunkowanych badań metabolomicznych. Wybraliśmy również losowo 70 przypadków z każdej grupy odkrywczej w przypadku ukierunkowanych badań metabolomicznych. Badacze nie znali przydziału do grup podczas zbierania i analizy danych LC-MS. Analizy statystyczne danych metabolomicznych i eksperymentów komórkowych opisano w odpowiednich sekcjach: Wyniki, Podpisy do rysunków i Metody. Kwantyfikacja tryptofanu komórkowego, NADT i aktywności glikolitycznej została przeprowadzona trzykrotnie niezależnie z identycznymi wynikami.
Więcej informacji na temat projektu badania można znaleźć w streszczeniu raportu Natural Portfolio Report powiązanym z tym artykułem.
Surowe dane MS wyodrębnionych cech oraz znormalizowane dane MS surowicy referencyjnej przedstawiono odpowiednio w Danych Uzupełniających 1 i Danych Uzupełniających 2. Adnotacje pików dla cech różnicowych przedstawiono w Danych Uzupełniających 3. Zestaw danych LUAD TCGA można pobrać ze strony https://portal.gdc.cancer.gov/. Dane wejściowe do sporządzenia wykresu znajdują się w danych źródłowych. Dane źródłowe podano dla tego artykułu.
Narodowa Grupa Badawcza ds. Badań Przesiewowych Płuc itp. Zmniejszenie śmiertelności z powodu raka płuc dzięki tomografii komputerowej o niskiej dawce promieniowania. Północna Anglia. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR i Prophet, PC Badania przesiewowe raka płuc z wykorzystaniem tomografii komputerowej o małej dawce: wyniki Narodowego Badania Przesiewowego Płuc (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ i wsp. Zmniejszenie śmiertelności z powodu raka płuc dzięki badaniu przesiewowemu wolumetrycznej tomografii komputerowej w badaniu randomizowanym. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Czas publikacji: 18.09.2023