Diagnostyka różnicowa guzków płuc wykrywanych za pomocą tomografii komputerowej (CT) pozostaje wyzwaniem w praktyce klinicznej.Tutaj charakteryzujemy globalny metabolom 480 próbek surowicy, w tym zdrowe kontrole, łagodne guzki płuc i gruczolakoraka płuc w stadium I.Gruczolakoraki wykazują unikalne profile metabolomiczne, podczas gdy łagodne guzki i osoby zdrowe mają duże podobieństwo profili metabolomicznych.W grupie odkrywczej (n = 306) zidentyfikowano zestaw 27 metabolitów umożliwiających rozróżnienie guzków łagodnych i złośliwych.AUC modelu dyskryminacyjnego w grupach z walidacją wewnętrzną (n = 104) i walidacją zewnętrzną (n = 111) wyniosło odpowiednio 0,915 i 0,945.Analiza szlaku ujawniła zwiększone metabolity glikolityczne związane ze zmniejszonym poziomem tryptofanu w surowicy gruczolakoraka płuc w porównaniu z łagodnymi guzkami i zdrowymi kontrolami i zasugerowała, że wychwyt tryptofanu sprzyja glikolizie w komórkach raka płuc.Nasze badanie podkreśla wartość biomarkerów metabolitów surowicy w ocenie ryzyka wystąpienia guzków płucnych wykrytych w tomografii komputerowej.
Wczesna diagnoza ma kluczowe znaczenie dla poprawy przeżywalności pacjentów chorych na raka.Wyniki amerykańskiego badania przesiewowego w kierunku raka płuc (NLST) i europejskiego badania NELSON wykazały, że badania przesiewowe za pomocą tomografii komputerowej o niskiej dawce (LDCT) mogą znacznie zmniejszyć śmiertelność z powodu raka płuc w grupach wysokiego ryzyka1,2,3.Od czasu powszechnego stosowania LDCT w badaniach przesiewowych w kierunku raka płuc częstość występowania przypadkowych zmian radiograficznych w postaci bezobjawowych guzków płucnych stale rośnie 4 .Guzki płucne definiuje się jako ogniskowe zmętnienia o średnicy do 3 cm 5 .Mamy trudności z oceną prawdopodobieństwa nowotworu złośliwego i radzeniem sobie z dużą liczbą guzków płucnych wykrywanych przypadkowo w badaniu LDCT.Ograniczenia CT mogą prowadzić do częstych badań kontrolnych i fałszywie dodatnich wyników, co prowadzi do niepotrzebnej interwencji i nadmiernego leczenia6.Dlatego istnieje potrzeba opracowania wiarygodnych i użytecznych biomarkerów umożliwiających prawidłową identyfikację raka płuc we wczesnych stadiach i różnicowanie większości łagodnych guzków już przy wstępnym wykryciu 7 .
Kompleksowa analiza molekularna krwi (surowicy, osocza, komórek jednojądrzastych krwi obwodowej), obejmująca genomikę, proteomikę czy metylację DNA8,9,10, spowodowała rosnące zainteresowanie odkryciem biomarkerów diagnostycznych raka płuc.Tymczasem podejścia metabolomiczne mierzą komórkowe produkty końcowe, na które wpływają działania endogenne i egzogenne, i dlatego stosuje się je do przewidywania początku i wyniku choroby.Chromatografia cieczowa-tandemowa spektrometria mas (LC-MS) jest szeroko stosowaną metodą w badaniach metabolomicznych ze względu na jej wysoką czułość i duży zakres dynamiczny, który może obejmować metabolity o różnych właściwościach fizykochemicznych11,12,13.Chociaż globalną analizę metabolomiczną osocza/surowicy przeprowadzono w celu identyfikacji biomarkerów związanych z rozpoznaniem raka płuc14,15,16,17 i skutecznością leczenia,18 klasyfikatory metabolitów w surowicy umożliwiające rozróżnienie łagodnych i złośliwych guzków płuc nadal wymagają wielu badań.-masowe badania.
Gruczolakorak i rak płaskonabłonkowy to dwa główne podtypy niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC).Różne badania przesiewowe CT wskazują, że gruczolakorak jest najczęstszym typem histologicznym raka płuc1,19,20,21.W tym badaniu wykorzystaliśmy ultrasprawną chromatografię cieczową i spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) do przeprowadzenia analizy metabolomicznej łącznie 695 próbek surowicy, w tym zdrowych kontroli, łagodnych guzków płucnych i wykrytych za pomocą CT ≤3 cm.Badania przesiewowe w kierunku gruczolakoraka płuc w stadium I.Zidentyfikowaliśmy panel metabolitów w surowicy, które odróżniają gruczolakoraka płuc od łagodnych guzków i zdrowych kontroli.Analiza wzbogacenia szlaku ujawniła, że nieprawidłowy metabolizm tryptofanu i glukozy jest częstymi zmianami w gruczolakoraku płuc w porównaniu z łagodnymi guzkami i zdrową grupą kontrolną.Na koniec ustaliliśmy i zweryfikowaliśmy klasyfikator metaboliczny surowicy o wysokiej swoistości i czułości umożliwiający rozróżnienie złośliwych i łagodnych guzków płucnych wykrytych za pomocą LDCT, co może pomóc we wczesnej diagnostyce różnicowej i ocenie ryzyka.
W bieżącym badaniu retrospektywnie pobrano próbki surowicy dopasowane pod względem płci i wieku od 174 zdrowych osób z grupy kontrolnej, 292 pacjentów z łagodnymi guzkami płuc i 229 pacjentów z gruczolakorakiem płuc w I stadium.Charakterystykę demograficzną 695 osób przedstawiono w tabeli uzupełniającej 1.
Jak pokazano na rycinie 1a, w Centrum Onkologii Uniwersytetu Sun Yat-sen pobrano łącznie 480 próbek surowicy, w tym 174 zdrowe próbki kontrolne (HC), 170 łagodnych guzków (BN) i 136 próbek gruczolakoraka płuc (LA) w stadium I.Kohorta odkrywcza do nieukierunkowanego profilowania metabolomicznego przy użyciu ultrawydajnej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS).Jak pokazano na dodatkowym rysunku 1, zidentyfikowano różnicowe metabolity między LA i HC, LA i BN w celu ustalenia modelu klasyfikacji i dalszego zbadania analizy szlaków różnicowych.104 próbki pobrane przez Centrum Onkologii Uniwersytetu Sun Yat-sen i 111 próbek pobranych przez dwa inne szpitale poddano odpowiednio walidacji wewnętrznej i zewnętrznej.
a Populacja badana w kohorcie odkrywców, która została poddana globalnej analizie metabolomiki surowicy przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS).b Analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów (PLS-DA) całkowitego metabolomu 480 próbek surowicy z kohorty badawczej, w tym zdrowe kontrole (HC, n = 174), łagodne guzki (BN, n = 170) i gruczolakorak płuc w stadium I (Los Angeles, n = 136).+ESI, tryb dodatniej jonizacji przez elektrorozpylanie, -ESI, tryb ujemnej jonizacji przez elektrorozpylanie.c–e Metabolity o istotnie różnej liczebności w dwóch danych grupach (dwustronny test rang Wilcoxona ze znakiem Wilcoxona, wartość p skorygowana o współczynnik fałszywych odkryć, FDR <0,05) pokazano na czerwono (krotność zmiany > 1,2) i na niebiesko (krotność zmiany < 0,83) .) pokazany na grafice wulkanu.f Hierarchiczna mapa cieplna grupowania pokazująca znaczące różnice w liczbie opisanych metabolitów między LA i BN.Dane źródłowe dostarczane są w formie plików danych źródłowych.
Całkowity metabolom surowicy wynoszący 174 HC, 170 BN i 136 LA w grupie odkrytej analizowano za pomocą analizy UPLC-HRMS.Najpierw pokazujemy, że próbki kontroli jakości (QC) skupiają się ściśle w środku modelu nienadzorowanej analizy głównych składowych (PCA), potwierdzając stabilność wyników bieżącego badania (rysunek uzupełniający 2).
Jak pokazano w analizie dyskryminacyjnej częściowych najmniejszych kwadratów (PLS-DA) na rysunku 1b, odkryliśmy, że istnieją wyraźne różnice między LA i BN, LA i HC w dodatnich (+ESI) i ujemnych (-ESI) trybach jonizacji przez elektrorozpylanie .odosobniony.Nie stwierdzono jednak znaczących różnic pomiędzy BN i HC w warunkach +ESI i -ESI.
Znaleźliśmy 382 cechy różnicujące między LA i HC, 231 cech różnicujących między LA i BN oraz 95 cech różnicujących między BN i HC (test rang ze znakiem Wilcoxona, FDR <0,05 i wielokrotna zmiana >1,2 lub <0,83) (ryc. 1c-e )..Piki następnie opatrzono adnotacjami (dane uzupełniające 3) w odniesieniu do bazy danych (biblioteka mzCloud/HMDB/Chemspider) według wartości m/z, czasu retencji i przeszukiwania widma masowego fragmentacji (szczegóły opisane w sekcji Metody) 22 .Na koniec zidentyfikowano 33 i 38 opisanych metabolitów o znaczących różnicach w liczebności odpowiednio dla LA w porównaniu z BN (rysunek 1f i tabela uzupełniająca 2) oraz LA w porównaniu z HC (rysunek uzupełniający 3 i tabela uzupełniająca 2).Natomiast w BN i HC zidentyfikowano tylko 3 metabolity o znaczących różnicach w liczebności (tabela uzupełniająca 2), co jest zgodne z nakładaniem się BN i HC w PLS-DA.Te zróżnicowane metabolity obejmują szeroki zakres substancji biochemicznych (rysunek uzupełniający 4).Podsumowując, wyniki te wskazują na znaczące zmiany w metabolomie surowicy, które odzwierciedlają złośliwą transformację raka płuc we wczesnym stadium w porównaniu z łagodnymi guzkami płuc lub zdrowymi osobami.Tymczasem podobieństwo metabolomu BN i HC w surowicy sugeruje, że łagodne guzki płucne mogą mieć wiele wspólnych cech biologicznych z osobami zdrowymi.Biorąc pod uwagę, że mutacje genu receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) są powszechne w podtypie 23 gruczolakoraka płuc, staraliśmy się określić wpływ mutacji powodujących na metabolom surowicy.Następnie przeanalizowaliśmy ogólny profil metabolomiczny 72 przypadków ze statusem EGFR w grupie gruczolakoraka płuc.Co ciekawe, w analizie PCA znaleźliśmy porównywalne profile między pacjentami z mutacją EGFR (n = 41) i pacjentami z typem dzikim EGFR (n = 31) (rysunek uzupełniający 5a).Zidentyfikowaliśmy jednak 7 metabolitów, których liczebność była znacząco zmieniona u pacjentów z mutacją EGFR w porównaniu z pacjentami z EGFR typu dzikiego (test t, p <0, 05 i krotna zmiana> 1, 2 lub <0, 83) (rysunek uzupełniający 5b).Większość tych metabolitów (5 z 7) to acylokarnityny, które odgrywają ważną rolę w szlakach utleniania kwasów tłuszczowych.
Jak pokazano w procesie pokazanym na Ryc. 2a, biomarkery do klasyfikacji guzków uzyskano przy użyciu operatorów najmniejszego bezwzględnego skurczu i selekcji w oparciu o 33 różne metabolity zidentyfikowane w LA (n = 136) i BN (n = 170).Najlepsza kombinacja zmiennych (LASSO) – binarny model regresji logistycznej.Do sprawdzenia wiarygodności modelu zastosowano dziesięciokrotną walidację krzyżową.Wybór zmiennych i regularyzacja parametrów są regulowane poprzez karę maksymalizacji wiarygodności za pomocą parametru λ24.Globalną analizę metabolomiczną przeprowadzono dalej niezależnie w grupach z walidacją wewnętrzną (n = 104) i walidacją zewnętrzną (n = 111), aby przetestować skuteczność klasyfikacji modelu dyskryminacyjnego.W rezultacie zidentyfikowano 27 metabolitów w zestawie odkryć jako najlepszy model dyskryminacyjny z największą średnią wartością AUC (ryc. 2b), spośród których 9 miało zwiększoną aktywność, a 18 obniżoną aktywność w LA w porównaniu z BN (ryc. 2c).
Proces tworzenia klasyfikatora guzków płucnych, obejmujący wybór najlepszego panelu metabolitów surowicy w zestawie odkryć przy użyciu binarnego modelu regresji logistycznej poprzez dziesięciokrotną weryfikację krzyżową i ocenę wydajności predykcyjnej w wewnętrznych i zewnętrznych zestawach walidacyjnych.b Statystyki krzyżowej walidacji modelu regresji LASSO dla selekcji biomarkerów metabolicznych.Liczby podane powyżej reprezentują średnią liczbę biomarkerów wybranych przy danym λ.Czerwona przerywana linia przedstawia średnią wartość AUC przy odpowiedniej lambdzie.Szare słupki błędów przedstawiają minimalne i maksymalne wartości AUC.Linia przerywana wskazuje najlepszy model z 27 wybranymi biomarkerami.AUC, obszar pod krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC).c Krotność zmian 27 wybranych metabolitów w grupie LA w porównaniu z grupą BN w grupie odkrytej.Kolumna czerwona – aktywacja.Niebieska kolumna oznacza spadek.d – f Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) pokazujące moc modelu dyskryminacyjnego opartego na 27 kombinacjach metabolitów w zestawach do odkrycia, walidacji wewnętrznej i zewnętrznej.Dane źródłowe dostarczane są w formie plików danych źródłowych.
Model predykcyjny utworzono w oparciu o ważone współczynniki regresji tych 27 metabolitów (tabela uzupełniająca 3).Analiza ROC oparta na tych 27 metabolitach dała wartość pola pod krzywą (AUC) wynoszącą 0, 933, czułość grupy odkrywającej wyniosła 0, 868, a swoistość 0, 859 (ryc. 2d).Tymczasem wśród 38 opisanych różnicowych metabolitów między LA i HC zestaw 16 metabolitów osiągnął AUC 0, 902 z czułością 0, 801 i swoistością 0, 856 w odróżnianiu LA od HC (rysunek uzupełniający 6a-c).Porównano także wartości AUC w oparciu o różne progi krotności zmiany dla różnych metabolitów.Odkryliśmy, że model klasyfikacji najlepiej radził sobie z rozróżnianiem LA i BN (HC), gdy poziom zmiany krotności ustawiono na 1,2 w porównaniu z 1,5 lub 2,0 (rysunek uzupełniający 7a, b).Model klasyfikacji oparty na 27 grupach metabolitów poddano dalszej walidacji w kohortach wewnętrznych i zewnętrznych.AUC wyniosło 0,915 (czułość 0,867, swoistość 0,811) dla walidacji wewnętrznej i 0,945 (czułość 0,810, swoistość 0,979) dla walidacji zewnętrznej (ryc. 2e, f).Aby ocenić efektywność międzylaboratoryjną, 40 próbek z kohorty zewnętrznej przeanalizowano w laboratorium zewnętrznym, jak opisano w części Metody.Dokładność klasyfikacji osiągnęła AUC wynoszącą 0,925 (rysunek uzupełniający 8).Ponieważ rak płaskonabłonkowy płuc (LUSC) jest drugim po gruczolakoraku płuc (LUAD) najczęstszym podtypem niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC), przetestowaliśmy również potwierdzoną potencjalną użyteczność profili metabolicznych.BN i 16 przypadków LUSC.AUC dyskryminacji między LUSC i BN wyniosło 0, 776 (rysunek uzupełniający 9), co wskazuje na gorszą zdolność w porównaniu z rozróżnianiem między LUAD i BN.
Badania wykazały, że wielkość guzków na obrazach CT jest dodatnio skorelowana z prawdopodobieństwem nowotworu złośliwego i pozostaje głównym wyznacznikiem leczenia guzków25,26,27.Analiza danych z dużej kohorty badania przesiewowego NELSON wykazała, że ryzyko nowotworu złośliwego u osób z węzłami < 5 mm było nawet podobne jak u osób bez węzłów 28 .Dlatego minimalny rozmiar wymagający regularnego monitorowania CT wynosi 5 mm zgodnie z zaleceniami Brytyjskiego Towarzystwa Chorób Klatki Piersiowej (BTS) i 6 mm zgodnie z zaleceniami Towarzystwa Fleischnera 29 .Jednak guzki większe niż 6 mm i nieposiadające oczywistych cech łagodnych, zwane nieokreślonymi guzkami płucnymi (IPN), pozostają głównym wyzwaniem w ocenie i leczeniu w praktyce klinicznej30,31.Następnie sprawdziliśmy, czy rozmiar guzka wpływa na sygnatury metabolomiczne, korzystając z połączonych próbek z kohort odkrycia i wewnętrznej walidacji.Koncentrując się na 27 zatwierdzonych biomarkerach, najpierw porównaliśmy profile PCA metabolomów HC i BN o średnicy poniżej 6 mm.Odkryliśmy, że większość punktów danych dla HC i BN nakładała się, co pokazuje, że poziomy metabolitów w surowicy były podobne w obu grupach (ryc. 3a).Mapy cech w różnych zakresach wielkości pozostały zachowane w BN i LA (ryc. 3b, c), podczas gdy zaobserwowano separację między guzkami złośliwymi i łagodnymi w zakresie 6–20 mm (ryc. 3d).W tej kohorcie AUC wynosiło 0,927, swoistość 0,868 i czułość 0,820 w przewidywaniu złośliwości guzków o średnicy od 6 do 20 mm (ryc. 3e, f).Nasze wyniki pokazują, że klasyfikator może wychwycić zmiany metaboliczne spowodowane wczesną transformacją złośliwą, niezależnie od wielkości guzka.
ad Porównanie profili PCA pomiędzy określonymi grupami w oparciu o klasyfikator metaboliczny 27 metabolitów.CC i BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.w LA 6–20 mm w porównaniu z LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm i LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Krzywa charakterystyki działania odbiornika (ROC) pokazująca wydajność modelu dyskryminacyjnego dla guzków 6–20 mm.f Wartości prawdopodobieństwa obliczono na podstawie modelu regresji logistycznej dla guzków o średnicy 6–20 mm.Szara przerywana linia przedstawia optymalną wartość odcięcia (0,455).Powyższe liczby przedstawiają odsetek przypadków przewidywany dla Los Angeles.Użyj dwustronnego testu t-Studenta.PCA, analiza głównych składowych.Pole AUC pod krzywą.Dane źródłowe dostarczane są w formie plików danych źródłowych.
Następnie wybrano cztery próbki (w wieku 44–61 lat) o podobnej wielkości guzków płucnych (7–9 mm), aby zilustrować skuteczność proponowanego modelu przewidywania złośliwości (ryc. 4a, b).Podczas wstępnego badania przesiewowego przypadek 1 przedstawiał guzek lity ze zwapnieniem, cechę związaną z łagodnością, podczas gdy przypadek 2 przedstawiał się jako nieokreślony, częściowo lity guzek, bez wyraźnych cech łagodnych.Trzy rundy kontrolnej tomografii komputerowej wykazały, że przypadki te pozostawały stabilne przez okres 4 lat i dlatego uznano je za guzki łagodne (ryc. 4a).W porównaniu z oceną kliniczną seryjnych tomografii komputerowej, jednorazowa analiza metabolitów w surowicy przy użyciu bieżącego modelu klasyfikatora szybko i prawidłowo zidentyfikowała te łagodne guzki w oparciu o ograniczenia probabilistyczne (Tabela 1).Rycina 4b w przypadku 3 przedstawia guzek z cechami retrakcji opłucnej, co najczęściej wiąże się ze nowotworem złośliwym32.Przypadek 4 przedstawiono jako nieokreślony, częściowo lity guzek, bez dowodów na łagodną przyczynę.Wszystkie te przypadki uznano za złośliwe zgodnie z modelem klasyfikatora (tabela 1).Ocenę gruczolakoraka płuc przeprowadzono na podstawie badania histopatologicznego po operacji resekcji płuc (ryc. 4b).W przypadku zestawu walidacji zewnętrznej klasyfikator metaboliczny dokładnie przewidział dwa przypadki nieokreślonych guzków płuc większych niż 6 mm (rysunek uzupełniający 10).
Obrazy CT okienka osiowego płuc dwóch przypadków łagodnych guzków.W przypadku 1. tomografia komputerowa po 4 latach wykazała stabilny, lity guzek o średnicy 7 mm ze zwapnieniem w prawym dolnym płacie.W przypadku 2 w tomografii komputerowej po 5 latach stwierdzono stabilny, częściowo lity guzek o średnicy 7 mm w prawym górnym płacie.b Obrazy TK płuc w osiowym okienku i odpowiadające im badania patologiczne dwóch przypadków gruczolakoraka w stadium I przed resekcją płuc.W przypadku 3. w prawym górnym płacie stwierdzono guzek o średnicy 8 mm z retrakcją opłucnej.Przypadek 4 ujawnił częściowo lity guzek ze szlifowanego szkła o średnicy 9 mm w lewym górnym płacie.Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) usuniętej tkanki płuc (pasek skali = 50 μm) wykazujące zrazikowy wzór wzrostu gruczolakoraka płuc.Strzałki wskazują guzki wykryte na obrazach CT.Obrazy H&E są reprezentatywnymi obrazami wielu (>3) pól mikroskopowych badanych przez patologa.
Podsumowując, nasze wyniki wskazują na potencjalną wartość biomarkerów metabolitów w surowicy w diagnostyce różnicowej guzków płucnych, co może stanowić wyzwanie przy ocenie badań przesiewowych CT.
W oparciu o zatwierdzony panel różnicowych metabolitów staraliśmy się zidentyfikować biologiczne korelaty głównych zmian metabolicznych.Analiza wzbogacenia szlaku KEGG przeprowadzona przez MetaboAnalyst zidentyfikowała 6 wspólnych, znacząco zmienionych szlaków pomiędzy dwiema podanymi grupami (LA vs. HC i LA vs. BN, skorygowane p ≤ 0,001, efekt > 0,01).Zmiany te charakteryzowały się zaburzeniami metabolizmu pirogronianu, tryptofanu, niacyny i nikotynamidu, glikolizy, cyklu TCA i metabolizmu puryn (ryc. 5a).Następnie przeprowadziliśmy dalej ukierunkowaną metabolomię, aby zweryfikować główne zmiany za pomocą bezwzględnej analizy ilościowej.Oznaczanie powszechnych metabolitów w często zmienionych szlakach za pomocą spektrometrii mas z potrójnym kwadrupolem (QQQ) przy użyciu autentycznych standardów metabolitów.Charakterystykę demograficzną docelowej próbki do badania metabolomiki przedstawiono w tabeli uzupełniającej 4. Zgodnie z naszymi globalnymi wynikami metabolomiki, analiza ilościowa potwierdziła, że hipoksantyna i ksantyna, pirogronian i mleczan wzrosły w LA w porównaniu z BN i HC (ryc. 5b, c, p<0,05).Jednakże nie stwierdzono znaczących różnic w tych metabolitach pomiędzy BN i HC.
Analiza wzbogacenia szlaku KEGG w znacząco różne metabolity w grupie LA w porównaniu z grupami BN i HC.Zastosowano dwustronny Globaltest, a wartości p skorygowano metodą Holma-Bonferroniego (skorygowane p ≤ 0,001 i wielkość efektu > 0,01).b – d Wykresy skrzypiec przedstawiające poziomy hipoksantyny, ksantyny, mleczanu, pirogronianu i tryptofanu w HC, BN i LA w surowicy określone metodą LC-MS/MS (n = 70 na grupę).Białe i czarne przerywane linie wskazują odpowiednio medianę i kwartyl.e Wykres skrzypiec przedstawiający znormalizowaną ekspresję mRNA Log2TPM (transkrypty na milion) SLC7A5 i QPRT w gruczolakoraku płuc (n = 513) w porównaniu z prawidłową tkanką płuc (n = 59) w zbiorze danych LUAD-TCGA.Białe pole przedstawia rozstęp międzykwartylowy, pozioma czarna linia pośrodku przedstawia medianę, a pionowa czarna linia wychodząca z prostokąta przedstawia 95% przedział ufności (CI).f Wykres korelacji Pearsona dla ekspresji SLC7A5 i GAPDH w gruczolakoraku płuc (n = 513) i prawidłowej tkance płuc (n = 59) w zbiorze danych TCGA.Szary obszar reprezentuje 95% CI.r, współczynnik korelacji Pearsona.g Znormalizowane poziomy tryptofanu w komórkach A549 transfekowanych nieswoistą kontrolą shRNA (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) określone metodą LC-MS/MS.Przedstawiono analizę statystyczną pięciu biologicznie niezależnych próbek w każdej grupie.h Poziomy komórkowe NADt (całkowity NAD, w tym NAD+ i NADH) w komórkach A549 (NC) i komórkach A549 z nokautem SLC7A5 (Sh1, Sh2).Przedstawiono analizę statystyczną trzech biologicznie niezależnych próbek w każdej grupie.i Aktywność glikolityczną komórek A549 przed i po knockdown SLC7A5 mierzono za pomocą szybkości zakwaszania zewnątrzkomórkowego (ECAR) (n = 4 biologicznie niezależne próbki na grupę).2-DG,2-deoksy-D-glukoza.W (b – h) zastosowano dwustronny test t-Studenta.W (g – i) słupki błędów przedstawiają średnią ± SD, każdy eksperyment przeprowadzono niezależnie trzy razy, a wyniki były podobne.Dane źródłowe dostarczane są w formie plików danych źródłowych.
Biorąc pod uwagę znaczący wpływ zmienionego metabolizmu tryptofanu w grupie LA, oceniliśmy również poziomy tryptofanu w surowicy w grupach HC, BN i LA za pomocą QQQ.Stwierdziliśmy, że u chorych na raka płuc poziom tryptofanu w surowicy był obniżony w porównaniu z HC lub BN (p < 0,001, ryc. 5d), co jest zgodne z wcześniejszymi ustaleniami, że poziom tryptofanu w krwiobiegu jest niższy u pacjentów z rakiem płuc w porównaniu do zdrowych osób kontrolnych z grupy kontrolnej33,34 ,35.Inne badanie z użyciem znacznika PET/CT 11C-metylo-L-tryptofanu wykazało, że czas retencji sygnału tryptofanu w tkance raka płuc był znacząco wydłużony w porównaniu ze zmianami łagodnymi lub tkanką prawidłową36.Postawiliśmy hipotezę, że spadek tryptofanu w surowicy LA może odzwierciedlać aktywny wychwyt tryptofanu przez komórki raka płuc.
Wiadomo również, że końcowym produktem szlaku kinureninowego katabolizmu tryptofanu jest NAD+37,38, który jest ważnym substratem reakcji aldehydu 3-glicerynowego z 1,3-bisfosfoglicerynianem w procesie glikolizy39.Podczas gdy poprzednie badania skupiały się na roli katabolizmu tryptofanu w regulacji układu odpornościowego, staraliśmy się wyjaśnić wzajemne oddziaływanie między rozregulowaniem tryptofanu a szlakami glikolitycznymi obserwowanymi w bieżącym badaniu.Wiadomo, że członek 5 rodziny transporterów substancji rozpuszczonych (SLC7A5) jest transporterem tryptofanu43,44,45.Fosforybozylotransferaza kwasu chinolinowego (QPRT) to enzym zlokalizowany poniżej szlaku kinureninowego, który przekształca kwas chinolinowy w NAMN46.Kontrola zbioru danych LUAD TCGA ujawniła, że zarówno SLC7A5, jak i QPRT były znacznie zwiększone w tkance nowotworowej w porównaniu z tkanką prawidłową (ryc. 5e).Wzrost ten zaobserwowano w stadiach I i II, a także w stadiach III i IV gruczolakoraka płuc (rysunek uzupełniający 11), co wskazuje na wczesne zaburzenia metabolizmu tryptofanu związane z powstawaniem nowotworów.
Dodatkowo zestaw danych LUAD-TCGA wykazał dodatnią korelację między ekspresją mRNA SLC7A5 i GAPDH w próbkach pacjentów chorych na raka (r = 0, 45, p = 1, 55E-26, Figura 5f).Natomiast nie stwierdzono istotnej korelacji między takimi sygnaturami genów w normalnej tkance płuc (r = 0, 25, p = 0, 06, ryc. 5f).Powalenie SLC7A5 (rysunek uzupełniający 12) w komórkach A549 znacznie obniżyło komórkowe poziomy tryptofanu i NAD (H) (ryc. 5g, h), powodując osłabioną aktywność glikolityczną mierzoną szybkością zakwaszania zewnątrzkomórkowego (ECAR) (ryc. 1).5i).Zatem w oparciu o zmiany metaboliczne w surowicy i wykrywanie in vitro stawiamy hipotezę, że metabolizm tryptofanu może wytwarzać NAD+ poprzez szlak kinureninowy i odgrywać ważną rolę w promowaniu glikolizy w raku płuc.
Badania wykazały, że duża liczba nieokreślonych guzków płucnych wykrytych za pomocą LDCT może prowadzić do konieczności wykonania dodatkowych badań, takich jak PET-CT, biopsji płuc, a także nadmiernego leczenia ze względu na fałszywie dodatnią diagnozę nowotworu złośliwego.31 Jak pokazano na rycinie 6, w naszym badaniu zidentyfikowano panel metabolitów w surowicy o potencjalnej wartości diagnostycznej, która może poprawić stratyfikację ryzyka i późniejsze postępowanie w przypadku guzków płucnych wykrytych za pomocą tomografii komputerowej.
Guzki płucne ocenia się za pomocą tomografii komputerowej o niskiej dawce (LDCT), której obraz obrazowy sugeruje przyczynę łagodną lub złośliwą.Niepewny wynik guzków może prowadzić do częstych wizyt kontrolnych, niepotrzebnych interwencji i nadmiernego leczenia.Włączenie klasyfikatorów metabolicznych surowicy o wartości diagnostycznej może poprawić ocenę ryzyka i późniejsze leczenie guzków płucnych.Pozytonowa tomografia emisyjna PET.
Dane z amerykańskiego badania NLST i europejskiego badania NELSON sugerują, że badania przesiewowe grup wysokiego ryzyka za pomocą tomografii komputerowej o niskiej dawce (LDCT) mogą zmniejszyć śmiertelność z powodu raka płuc1,3.Jednak ocena ryzyka i późniejsze postępowanie kliniczne w przypadku dużej liczby przypadkowych guzków płucnych wykrytych za pomocą LDCT nadal stanowią największe wyzwanie.Głównym celem jest optymalizacja prawidłowej klasyfikacji istniejących protokołów opartych na LDCT poprzez włączenie wiarygodnych biomarkerów.
Niektóre biomarkery molekularne, takie jak metabolity krwi, zidentyfikowano poprzez porównanie raka płuc ze zdrową grupą kontrolną15,17.W obecnym badaniu skupiliśmy się na zastosowaniu analizy metabolomiki surowicy do rozróżnienia łagodnych i złośliwych guzków płucnych przypadkowo wykrytych za pomocą LDCT.Porównaliśmy globalny metabolom surowicy zdrowych próbek kontrolnych (HC), łagodnych guzków płuc (BN) i gruczolakoraka płuc (LA) w stadium I, stosując analizę UPLC-HRMS.Odkryliśmy, że HC i BN miały podobne profile metaboliczne, podczas gdy LA wykazywało istotne zmiany w porównaniu z HC i BN.Zidentyfikowaliśmy dwa zestawy metabolitów surowicy, które odróżniają LA od HC i BN.
Obecny schemat identyfikacji guzków łagodnych i złośliwych oparty na LDCT opiera się głównie na wielkości, gęstości, morfologii i szybkości wzrostu guzków w czasie30.Poprzednie badania wykazały, że wielkość guzków jest ściśle powiązana z prawdopodobieństwem wystąpienia raka płuc.Nawet u pacjentów wysokiego ryzyka ryzyko nowotworu złośliwego w węzłach <6 mm wynosi <1%.Ryzyko nowotworu złośliwego w przypadku guzków o średnicy od 6 do 20 mm waha się od 8% do 64%30.Dlatego Towarzystwo Fleischnera zaleca średnicę odcięcia wynoszącą 6 mm w rutynowych badaniach kontrolnych CT.29 Jednakże ocena ryzyka i leczenie nieokreślonych guzków płucnych (IPN) większych niż 6 mm nie zostały odpowiednio przeprowadzone 31 .Obecne leczenie wrodzonych wad serca opiera się zwykle na uważnym oczekiwaniu i częstym monitorowaniu CT.
W oparciu o zatwierdzony metabolom po raz pierwszy wykazaliśmy nakładanie się sygnatur metabolomicznych u zdrowych osób i łagodnych guzków < 6 mm.Podobieństwo biologiczne jest zgodne z wcześniejszymi wynikami tomografii komputerowej, zgodnie z którymi ryzyko nowotworu złośliwego w przypadku guzków <6 mm jest tak samo niskie, jak u osób bez węzłów.30 Należy zauważyć, że nasze wyniki pokazują również, że guzki łagodne <6 mm i ≥6 mm mają wysoką podobieństwo profili metabolomicznych, co sugeruje, że funkcjonalna definicja łagodnej etiologii jest spójna niezależnie od wielkości guzka.Zatem nowoczesne panele diagnostyczne dotyczące metabolitów w surowicy mogą zapewniać pojedyncze oznaczenie jako badanie wykluczające, gdy guzki zostaną początkowo wykryte w tomografii komputerowej, co może potencjalnie ograniczyć monitorowanie seryjne.Jednocześnie ten sam panel biomarkerów metabolicznych odróżnił guzki złośliwe o wielkości ≥6 mm od guzków łagodnych i dostarczył dokładnych przewidywań dla IPN o podobnej wielkości i niejednoznacznych cechach morfologicznych na obrazach CT.Ten klasyfikator metabolizmu w surowicy dobrze sprawdzał się w przewidywaniu złośliwości guzków ≥6 mm przy AUC wynoszącym 0,927.Podsumowując, nasze wyniki wskazują, że unikalne sygnatury metabolomiczne w surowicy mogą specyficznie odzwierciedlać wczesne zmiany metaboliczne wywołane nowotworem i mieć potencjalną wartość jako predyktory ryzyka, niezależnie od wielkości guzka.
Warto zauważyć, że głównymi typami niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC) są gruczolakorak płuc (LUAD) i rak kolczystokomórkowy (LUSC).Biorąc pod uwagę, że LUSC jest silnie powiązany z używaniem tytoniu47, a LUAD jest najczęstszą histologią przypadkowych guzków płuc wykrywanych podczas badań przesiewowych CT48, nasz model klasyfikatora został zbudowany specjalnie dla próbek gruczolakoraka w stadium I.Wang i współpracownicy również skupili się na LUAD i zidentyfikowali dziewięć sygnatur lipidowych za pomocą lipidomiki, aby odróżnić raka płuc we wczesnym stadium od osób zdrowych17.Przetestowaliśmy obecny model klasyfikatora na 16 przypadkach LUSC w stadium I i 74 łagodnych guzkach i zaobserwowaliśmy niską dokładność przewidywania LUSC (AUC 0,776), co sugeruje, że LUAD i LUSC mogą mieć własne sygnatury metabolomiczne.Rzeczywiście wykazano, że LUAD i LUSC różnią się etiologią, pochodzeniem biologicznym i aberracjami genetycznymi49.Dlatego też inne typy histologii powinny zostać uwzględnione w modelach szkoleniowych w zakresie populacyjnego wykrywania raka płuc w programach badań przesiewowych.
Tutaj zidentyfikowaliśmy sześć najczęściej zmienianych szlaków w gruczolakoraku płuc w porównaniu ze zdrowymi kontrolami i łagodnymi guzkami.Ksantyna i hipoksantyna są powszechnymi metabolitami szlaku metabolicznego puryn.Zgodnie z naszymi wynikami, ilość związków pośrednich związanych z metabolizmem puryn była znacząco zwiększona w surowicy lub tkankach pacjentów z gruczolakorakiem płuc w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną lub pacjentami w stadium przedinwazyjnym15,50.Podwyższony poziom ksantyny i hipoksantyny w surowicy może odzwierciedlać anabolizm wymagany przez szybko proliferujące komórki nowotworowe.Rozregulowanie metabolizmu glukozy jest dobrze znaną cechą metabolizmu nowotworów51.Tutaj zaobserwowaliśmy znaczny wzrost pirogronianu i mleczanu w grupie LA w porównaniu z grupą HC i BN, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami o nieprawidłowościach szlaku glikolitycznego w profilach metabolomu w surowicy pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC) i zdrowe kontrole.wyniki są spójne52,53.
Co ważne, zaobserwowaliśmy odwrotną korelację pomiędzy metabolizmem pirogronianu i tryptofanu w surowicy chorych na gruczolakoraka płuc.Poziom tryptofanu w surowicy był obniżony w grupie LA w porównaniu z grupą HC lub BN.Co ciekawe, poprzednie badanie na dużą skalę z udziałem prospektywnej kohorty wykazało, że niski poziom krążącego tryptofanu był powiązany ze zwiększonym ryzykiem raka płuc 54 .Tryptofan jest niezbędnym aminokwasem, który otrzymujemy wyłącznie z pożywienia.Wnioskujemy, że niedobór tryptofanu w surowicy w gruczolakoraku płuc może odzwierciedlać szybkie wyczerpanie się tego metabolitu.Powszechnie wiadomo, że końcowy produkt katabolizmu tryptofanu na szlaku kinureninowym jest źródłem syntezy NAD+ de novo.Ponieważ NAD+ jest wytwarzany głównie na drodze ratunkowej, znaczenie NAD+ w metabolizmie tryptofanu w zdrowiu i chorobie pozostaje do ustalenia46.Nasza analiza bazy danych TCGA wykazała, że ekspresja transportera substancji rozpuszczonej transportera tryptofanu 7A5 (SLC7A5) była znacząco zwiększona w gruczolakoraku płuc w porównaniu z normalnymi kontrolami i była dodatnio skorelowana z ekspresją enzymu glikolitycznego GAPDH.Poprzednie badania skupiały się głównie na roli katabolizmu tryptofanu w tłumieniu przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej40,41,42.Tutaj pokazujemy, że hamowanie wychwytu tryptofanu przez knockdown SLC7A5 w komórkach raka płuc powoduje późniejsze obniżenie poziomów komórkowych NAD i jednoczesne osłabienie aktywności glikolitycznej.Podsumowując, nasze badanie dostarcza biologicznych podstaw dla zmian w metabolizmie surowicy związanych ze złośliwą transformacją gruczolakoraka płuc.
Mutacje EGFR są najczęstszymi mutacjami napędowymi u pacjentów z NSCLC.W naszym badaniu odkryliśmy, że pacjenci z mutacją EGFR (n = 41) mieli ogólny profil metabolomiczny podobny do pacjentów z EGFR typu dzikiego (n = 31), chociaż stwierdziliśmy obniżone poziomy w surowicy u niektórych pacjentów z mutacją EGFR u pacjentów leczonych acylokarnityną.Ustaloną funkcją acylokarnityn jest transport grup acylowych z cytoplazmy do matrix mitochondrialnej, co prowadzi do utleniania kwasów tłuszczowych w celu wytworzenia energii 55 .Zgodnie z naszymi ustaleniami, w niedawnym badaniu zidentyfikowano również podobne profile metabolomu między nowotworami z mutacją EGFR i nowotworami typu dzikiego EGFR, analizując globalny metabolom 102 próbek tkanki gruczolakoraka płuc50.Co ciekawe, zawartość acylokarnityny stwierdzono także w grupie mutantów EGFR.Dlatego też to, czy zmiany w poziomach acylokarnityny odzwierciedlają zmiany metaboliczne indukowane przez EGFR i leżące u ich podstaw szlaki molekularne, mogą zasługiwać na dalsze badania.
Podsumowując, w naszym badaniu opracowano klasyfikator metabolizmu surowicy do diagnostyki różnicowej guzków płucnych i zaproponowano schemat postępowania, który może zoptymalizować ocenę ryzyka i ułatwić postępowanie kliniczne w oparciu o badania przesiewowe tomografii komputerowej.
Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersyteckiego Szpitala Onkologicznego Sun Yat-sen, Pierwszy Szpital Stowarzyszony Uniwersytetu Sun Yat-sen oraz Komisję Etyki Uniwersyteckiego Szpitala Onkologicznego w Zhengzhou.W grupach odkrywania i wewnętrznej walidacji pobrano 174 surowice od zdrowych osób i 244 surowice z łagodnych guzków od osób poddawanych corocznym badaniom lekarskim w Wydziale Kontroli i Zapobiegania Nowotworom Centrum Onkologii Uniwersytetu Sun Yat-sen oraz 166 łagodnych guzków.serum.Gruczolakoraki płuc w stadium I pobrano z Centrum Onkologii Uniwersytetu Sun Yat-sen.W kohorcie poddanej walidacji zewnętrznej stwierdzono 48 przypadków łagodnych guzków, 39 przypadków gruczolakoraka płuc w I stopniu zaawansowania z Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Sun Yat-sena i 24 przypadki gruczolakoraka płuc w I stopniu zaawansowania ze Szpitala Onkologicznego w Zhengzhou.Centrum Onkologii Uniwersytetu Sun Yat-sen zebrało również 16 przypadków płaskonabłonkowego raka płuc w stadium I, aby przetestować zdolność diagnostyczną ustalonego klasyfikatora metabolicznego (charakterystykę pacjenta przedstawiono w tabeli uzupełniającej 5).Próbki z kohorty odkrywczej i kohorty objętej walidacją wewnętrzną pobrano w okresie od stycznia 2018 r. do maja 2020 r. Próbki do kohorty poddanej walidacji zewnętrznej pobrano w okresie od sierpnia 2021 r. do października 2022 r. Aby zminimalizować stronniczość ze względu na płeć, do każdego z nich przypisano w przybliżeniu równą liczbę przypadków mężczyzn i kobiet. kohorta.Zespół ds. odkryć i zespół ds. przeglądu wewnętrznego.Płeć uczestnika została określona na podstawie samoopisu.Od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę i nie zapewniono żadnego odszkodowania.Pacjentami z łagodnymi guzkami byli pacjenci ze stabilnym wynikiem tomografii komputerowej po 2 do 5 latach w momencie analizy, z wyjątkiem 1 przypadku z próbki do walidacji zewnętrznej, którą pobrano przed operacją i zdiagnozowano na podstawie badania histopatologicznego.Z wyjątkiem przewlekłego zapalenia oskrzeli.Przypadki gruczolakoraka płuc zebrano przed resekcją płuc i potwierdzono diagnozą patologiczną.Próbki krwi na czczo pobierano do probówek do separacji surowicy bez żadnych antykoagulantów.Próbki krwi skrzepano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano przy 2851 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C w celu zebrania supernatantu surowicy.Porcje surowicy zamrożono w temperaturze -80°C do czasu ekstrakcji metabolitu.Departament Zapobiegania Rakowi i Badań Lekarskich Centrum Onkologii Uniwersytetu Sun Yat-sen zebrał pulę surowicy od 100 zdrowych dawców, w tym równej liczby mężczyzn i kobiet w wieku od 40 do 55 lat.Zmieszano równe objętości próbek każdego dawcy, otrzymaną pulę podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze -80°C.Mieszaninę surowicy zastosowano jako materiał odniesienia do kontroli jakości i standaryzacji danych.
Surowicę referencyjną i próbki testowe rozmrożono, a metabolity ekstrahowano metodą łączonej ekstrakcji (MTBE/metanol/woda) 56 .W skrócie, 50 µl surowicy zmieszano z 225 µl lodowatego metanolu i 750 µl lodowatego eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE).Mieszać mieszaninę i inkubować na lodzie przez 1 godzinę.Próbki następnie zmieszano i zmieszano na worteksie ze 188 µl wody klasy MS zawierającej standardy wewnętrzne (mleczan 13C, pirogronian 13C3, metionina 13C i izoleucyna 13C6, zakupione od Cambridge Isotope Laboratories).Następnie mieszaninę odwirowano przy 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a dolną fazę przeniesiono do dwóch probówek (po 125 µl każda) w celu analizy LC-MS w trybie dodatnim i ujemnym.Na koniec próbkę odparowano do sucha w wysokoobrotowym koncentratorze próżniowym.
Wysuszone metabolity rekonstytuowano w 120 µl 80% acetonitrylu, wirowano przez 5 minut i wirowano przy 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.Supernatanty przeniesiono do fiolek ze szkła oranżowego z mikrowkładkami do badań metabolomicznych.Nieukierunkowana analiza metabolomiczna na ultrawydajnej platformie chromatografii cieczowej i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS).Metabolity rozdzielano przy użyciu systemu Dionex Ultimate 3000 UPLC i kolumny ACQUITY BEH Amide (2,1 x 100 mm, 1,7 µm, Waters).W trybie jonów dodatnich fazy ruchome składały się z 95% (A) i 50% acetonitrylu (B), każda zawierająca 10 mmol/l octanu amonu i 0,1% kwasu mrówkowego.W trybie ujemnym fazy ruchome A i B zawierały odpowiednio 95% i 50% acetonitrylu, obie fazy zawierały 10 mmol/l octanu amonu, pH = 9. Program gradientu był następujący: 0–0,5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1–20 min, 2% B. Kolumnę utrzymywano w temperaturze 40°C, a próbkę w temperaturze 10°C w autosamplerze.Szybkość przepływu wynosiła 0,3 ml/min, objętość wtrysku wynosiła 3 µl.Spektrometr masowy Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) ze źródłem jonizacji przez elektrorozpylanie (ESI) działał w trybie pełnego skanowania i był połączony z trybem monitorowania ddMS2 w celu zebrania dużych ilości danych.Parametry MS ustawiono następująco: napięcie natrysku +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura kapilary 320°C, gaz osłonowy 40 arb, gaz pomocniczy 10 arb, temperatura podgrzewacza sondy 350°C, zakres skanowania 70–1050 m/h, rezolucja.70 000. Dane uzyskano przy użyciu Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Aby ocenić jakość danych, wygenerowano zbiorcze próbki kontroli jakości (QC), usuwając 10 μl porcji supernatantu z każdej próbki.Na początku sekwencji analitycznej przeanalizowano sześć nastrzyków próbek kontroli jakości, aby ocenić stabilność systemu UPLC-MS.Następnie do partii okresowo wprowadza się próbki do kontroli jakości.Wszystkie 11 partii próbek surowicy w tym badaniu analizowano metodą LC-MS.Porcje mieszaniny puli surowicy od 100 zdrowych dawców wykorzystano jako materiał odniesienia w odpowiednich partiach w celu monitorowania procesu ekstrakcji i dostosowania pod kątem efektów między partiami.Nieukierunkowaną analizę metabolomiczną kohorty odkrywczej, kohorty walidacyjnej wewnętrznej i kohorty walidacyjnej zewnętrznej przeprowadzono w Centrum Metabolomiki Uniwersytetu Sun Yat-sena.Zewnętrzne laboratorium Centrum Analiz i Testów Uniwersytetu Technologicznego w Guangdong przeanalizowało również 40 próbek z kohorty zewnętrznej, aby przetestować działanie modelu klasyfikatora.
Po ekstrakcji i rekonstytucji zmierzono bezwzględną ilość metabolitów w surowicy przy użyciu ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (potrójny kwadrupol Agilent 6495) ze źródłem jonizacji przez elektrorozpylanie (ESI) w trybie monitorowania wielu reakcji (MRM).Do rozdzielenia metabolitów zastosowano kolumnę ACQUITY BEH Amide (2,1 x 100 mm, 1,7 µm, Waters).Faza ruchoma składała się z 90% (A) i 5% acetonitrylu (B) z 10 mmol/l octanu amonu i 0,1% roztworu amoniaku.Program gradientu był następujący: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min, 0–15% B;6,5–8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0%B.Kolumnę utrzymywano w temperaturze 40°C, a próbkę w temperaturze 10°C w autosamplerze.Szybkość przepływu wynosiła 0,3 ml/min, a objętość wstrzyknięcia wynosiła 1 µl.Parametry MS ustawiono następująco: napięcie kapilarne ±3,5 kV, ciśnienie nebulizatora 35 psi, przepływ gazu osłonowego 12 l/min, temperatura gazu osłonowego 350°C, temperatura gazu suszącego 250°C i przepływ gazu suszącego 14 l/min.Konwersje MRM tryptofanu, pirogronianu, mleczanu, hipoksantyny i ksantyny wynosiły 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 i 151,0–107.odpowiednio 9.Dane zebrano przy użyciu Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).W próbkach surowicy oznaczono ilościowo tryptofan, pirogronian, mleczan, hipoksantynę i ksantynę, stosując krzywe kalibracyjne roztworów mieszanin wzorcowych.W przypadku próbek komórek zawartość tryptofanu normalizowano w stosunku do wewnętrznego standardu i masy białka komórkowego.
Ekstrakcję pików (m/z i czas retencji (RT)) przeprowadzono przy użyciu Compound Discovery 3.1 i TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Aby wyeliminować potencjalne różnice między partiami, każdy charakterystyczny pik badanej próbki podzielono przez charakterystyczny pik materiału odniesienia z tej samej partii, aby uzyskać względną liczebność.Względne odchylenia standardowe standardów wewnętrznych przed i po standaryzacji pokazano w tabeli uzupełniającej 6. Różnice między obiema grupami charakteryzowały się współczynnikiem fałszywych odkryć (FDR <0, 05, test rang ze znakiem Wilcoxona) i krotnością zmiany (> 1, 2 lub <0, 83).Surowe dane MS dotyczące wyodrębnionych cech i referencyjne dane MS skorygowane o surowicę pokazano odpowiednio w danych uzupełniających 1 i danych uzupełniających 2.Adnotację pików przeprowadzono w oparciu o cztery zdefiniowane poziomy identyfikacji, obejmujące zidentyfikowane metabolity, przypuszczalnie opisane związki, przypuszczalnie scharakteryzowane klasy związków i nieznane związki 22 .W oparciu o przeszukiwanie baz danych w Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), ostatecznie wybrano związki biologiczne z zatwierdzonymi standardami odpowiadającymi MS/MS lub adnotacjami dokładnego dopasowania w mzCloud (wynik > 85) lub Chemspider jako produkty pośrednie pomiędzy różnicowym metabolomem.Adnotacje pików dla każdej cechy znajdują się w danych uzupełniających 3. MetaboAnalyst 5.0 zastosowano do analizy jednowymiarowej obfitości metabolitów znormalizowanych sumą.MetaboAnalyst 5.0 ocenił także analizę wzbogacania szlaku KEGG w oparciu o znacząco różne metabolity.Analizę głównych składowych (PCA) i analizę dyskryminacyjną częściowych najmniejszych kwadratów (PLS-DA) analizowano przy użyciu pakietu oprogramowania ropls (wersja 1.26.4) z normalizacją stosu i automatycznym skalowaniem.Optymalny model biomarkera metabolitów do przewidywania złośliwości guzka wygenerowano przy użyciu binarnej regresji logistycznej z operatorem najmniejszego bezwzględnego skurczu i selekcji (LASSO, pakiet R v.4.1-3).Wydajność modelu dyskryminacyjnego w zbiorach detekcyjnych i walidacyjnych scharakteryzowano poprzez oszacowanie AUC na podstawie analizy ROC zgodnie z pakietem pROC (wersja 1.18.0.).Optymalny punkt odcięcia prawdopodobieństwa uzyskano w oparciu o maksymalny wskaźnik Youdena modelu (czułość + swoistość – 1).Próbki o wartościach mniejszych lub większych niż próg będą przewidywane odpowiednio jako łagodne guzki i gruczolakorak płuc.
Komórki A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) hodowano w pożywce F-12K zawierającej 10% FBS.Sekwencje krótkiego RNA o strukturze spinki do włosów (shRNA) ukierunkowane na SLC7A5 i kontrolę nieukierunkowaną (NC) wstawiono do wektora lentiwirusowego pLKO.1-puro.Sekwencje antysensowne shSLC7A5 są następujące: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Przeciwciała przeciwko SLC7A5 (#5347) i tubulinie (#2148) zakupiono od Cell Signaling Technology.Do analizy Western blot zastosowano przeciwciała przeciwko SLC7A5 i tubulinie w rozcieńczeniu 1:1000.
Test stresu glikolitycznego Seahorse XF mierzy poziom zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR).W teście podawano kolejno glukozę, oligomycynę A i 2-DG w celu zbadania zdolności glikolitycznej komórek, mierzonej metodą ECAR.
Komórki A549 transfekowane nieukierunkowaną kontrolą (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) wysiano na noc na szalkach o średnicy 10 cm.Metabolity komórkowe ekstrahowano 1 ml lodowatego 80% wodnego metanolu.Komórki z roztworu metanolu zeskrobano, zebrano do nowej probówki i wirowano przy 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C.Zbierz 800 µl supernatantu i osusz za pomocą wysokoobrotowego koncentratora próżniowego.Następnie wysuszone peletki metabolitów analizowano pod kątem poziomów tryptofanu przy użyciu LC-MS/MS, jak opisano powyżej.Poziomy komórkowe NAD(H) w komórkach A549 (NC i shSLC7A5) mierzono przy użyciu ilościowego zestawu kolorymetrycznego NAD+/NADH (#K337, BioVision) zgodnie z instrukcjami producenta.Dla każdej próbki mierzono poziomy białka w celu normalizacji ilości metabolitów.
Do wstępnego określenia liczebności próby nie stosowano żadnych metod statystycznych.Poprzednie badania metabolomiczne mające na celu odkrycie biomarkerów15,18 uznano za punkty odniesienia przy określaniu wielkości i w porównaniu z tymi raportami nasza próba była odpowiednia.Żadna próba nie została wykluczona z kohorty badania.Próbki surowicy losowo przydzielono do grupy odkrywającej (306 przypadków, 74,6%) i grupy wewnętrznej walidacji (104 przypadki, 25,4%) na potrzeby nieukierunkowanych badań metabolomicznych.Wybraliśmy również losowo 70 przypadków z każdej grupy z zestawu odkryć do ukierunkowanych badań metabolomicznych.Badacze nie byli świadomi przydziału grup podczas gromadzenia i analizy danych LC-MS.Analizy statystyczne danych metabolomicznych i eksperymentów komórkowych opisano w odpowiednich sekcjach Wyniki, Legendy rysunków i Metody.Kwantyfikację komórkowego tryptofanu, NADT i aktywności glikolitycznej przeprowadzono trzy razy niezależnie z identycznymi wynikami.
Aby uzyskać więcej informacji na temat projektu badania, zobacz streszczenie raportu dotyczącego portfela naturalnego powiązane z tym artykułem.
Surowe dane MS wyekstrahowanych cech i znormalizowane dane MS surowicy referencyjnej pokazano odpowiednio w danych uzupełniających 1 i danych uzupełniających 2.Adnotacje pików dla cech różnicowych przedstawiono w danych uzupełniających 3. Zbiór danych LUAD TCGA można pobrać z https://portal.gdc.cancer.gov/.Dane wejściowe do wykreślenia wykresu znajdują się w danych źródłowych.W artykule podano dane źródłowe.
Krajowa Grupa Badawcza ds. Badań Przesiewowych Płuc itp. Zmniejszanie śmiertelności z powodu raka płuc dzięki niskodawkowej tomografii komputerowej.Północna Anglia.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR i Prophet, PC Badania przesiewowe w kierunku raka płuc za pomocą spiralnej tomografii komputerowej o niskiej dawce: wyniki z Krajowego badania przesiewowego płuc (NLST).J. Med.Ekran 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ i in.Zmniejszenie śmiertelności z powodu raka płuc dzięki wolumetrycznym badaniom przesiewowym CT w randomizowanym badaniu.Północna Anglia.J. Med.382, 503–513 (2020).
Czas publikacji: 18 września 2023 r